Патент на изобретение №2322259

(54) НОСИТЕЛЬ АНТИГЕНОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предлагается носитель антигенов в виде липидного комплекса, состоящего из гликозида, холестерина и липида. В качестве гликозида он содержит голотоксин A₁, а в качестве липида – моногалактозилдиацилглицериды (МГДГ) морских макрофитов, взятые в весовом соотношении 3 (голотоксин А₁):2(холестерин):(2-6) (МГДГ). Полученный гликозид-холестерин-липидный носитель имеет вытянутую нитевидно-тубулярную структуру. Применение полученного носителя антигенов позволяет повысить иммуногенную активность вакцинных препаратов, а также понизить или удалить полностью гемолитическую токсичность голотоксина A₁ и исключить воспалительные, болевые, токсические и гемолитические эффекты вакцин. 4 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а именно к препаратам, объединяющим систему доставки антигенов и природных медиаторов, и может быть использовано в области медицины и ветеринарии.

Создание нового поколения вакцин связано с использованием изолированных антигенов, способных обеспечить высокоспецифический иммунный ответ к бактериальным, вирусным патогенам и опухолевым клеткам. Преимущества высокоочищенных субъединичных вакцин по сравнению с традиционными средствами иммунизации характеризуются экономичностью и безопасностью производства, снижением риска возникновения побочных эффектов, возможностью получения препаратов для перорального приема. В то же время иммуногенность большинства индивидуальных антигенов в силу ряда особенностей, таких как низкая молекулярная масса антигена, растворимость, напрямую зависят и опосредуются стимуляцией клеточного звена иммунной системы, а именно Т-хелперных клеток. Поэтому разработка эффективных субъединичных вакцин сопровождается поиском надежных, безопасных и адекватных адъювантов.

Представляют интерес адъюванты липидной природы, используемые в качестве носителей в вакцинных препаратах. Липиды способны связывать одновременно адъюванты и амфифильные антигены и представлять их иммунокомпетентным клеткам в корпускулярной форме. Антигены в составе носителей обладают высокой иммунологической активностью, а сами носители – биодеградируемостью и отсутствием собственной иммуногенности. Комплексы на основе липидной матрицы имеют большие перспективы для решения проблемы адекватного и пролонгированного представления вакцинных антигенов иммунной системе.

Из уровня техники известно, что липидные носители могут существовать в виде эмульсий. Например, описаны водно-масляные растворы обратных мицелл и двухслойных везикул из растительного галактолипида дигалактозидиацилглицерола (ДГДГ) [пат. RU 2127124, опубл. 10.03.1999 г.]. Однако масляные адъюванты имеют ряд недостатков:

– при подкожном и внутримышечном введении вызывают местные реакции воспалительно-некротического характера, а повышенная вязкость затрудняет их введение;

– указанная эмульсия не дает существенного прироста иммуногенности белковых и других антигенов, поскольку сам ДГДГ не обладает иммуноадъювантными свойствами;

– нестабильность при хранении вакцины в готовом виде в результате расслоения фаз и нестандартность качества.

Из уровня техники также известно, что в качестве носителя для представления антигенов используют липосомы, основным структурообразующим компонентом которых является ламеллярный фосфатидилхолин [Allison AG, Gregoriadis G. Liposomes as immunological adjuvants. Nature. 1974. Nov 15; 252(5480):252].

Антигены в составе липосомальных препаратов могут рассматриваться как иммуноадъюванты. В отличие от других адъювантов в месте инъекции липосомальных препаратов образования гранулем не происходит и даже наблюдается предотвращение токсических проявлений инкапсулированных лекарственных средств.

Везикулы липосом могут включать как гидрофобный антигенный материал в липидном бислое, так и гидрофильный во внутренней фазе. Комплексы липосом с антигеном способны стимулировать антителообразование, активизировать фагоциты и поглощаться макрофагами в различных органах и тканях организма, обеспечивать доставку лекарственных средств (антигенов) в клетку. Ограничение их использования является следствием следующих недостатков:

– химическая и физическая нестабильность везикул;

– относительно умеренный иммунный ответ;

– неспособность стимулировать клеточный иммунный ответ, обеспечивающий противовирусную и противоопухолевую защиту.

По технической сущности и достигаемому результату наиболее близким к заявляемому техническому решению является иммуностимулирующий комплекс (ИСКОМ). Это липид-сапониновые частицы, состоящие из смеси растительных тритерпеновых гликозидов Quil А, холестерина и фосфолипидов [пат. RU 2120302, опубл. 20.10.1998 г.] (прототип). Такие комплексы имеют очень специфическую структуру, подтверждаемую данными электронной микроскопии и не являются липидными везикулами или липосомами. Это коллоидные частицы, состоящие из регулярных субъединиц, имеющих открытую сферическую структуру, которые под микроскопом выглядят как кольца. Основная структура ИСКОМ формируется как в присутствии антигена, так и без него. Структурной основой ИСКОМ является сапонин-холестериновый комплекс, способствующий развитию иммунного ответа. ИСКОМ позволяет на порядок снижать дозу вводимых антигенов, индуцировать существенный противовирусный иммунитет и повышать уровень гуморального иммунного ответа в дозах адъюванта намного меньших, чем в обычных вакцинах.

К серьезным недостаткам, препятствующим широкому использованию сапонинов Quil А в качестве адъювантов и системы доставки в составе вакцин против инфекционных заболеваний человека, относятся следующие:

– Quil А представляет собой гетерогенную смесь сапонинов, что является недопустимым для использования в медицине, поскольку смесь сапонинов с разными химическими и биологическими свойствами затрудняет стандартизацию ИСКОМ и может привести к непредсказуемым эффектам in vivo;

– высокая токсичность при внутривенном введении препарата, обусловленная высокой гемолитической активностью;

– воспалительные и болевые реакции у людей при внутримышечном введении, поэтому их использование в качестве неспецифического иммуностимулятора на человеке ограничивается пероральным введением;

– химическая нестабильность в водных растворах по причине гидролиза сложноэфирной связи в одной из боковых углеводородных цепей;

– деацилированные сапонины теряют адъювантные свойства, способность стимулировать Т-клеточный иммунный ответ первого класса и продуцировать антиген-специфические цитотоксические Т-лимфоциты, что негативно сказывается на эффективности вакцин против цитопатических инфекций вирусной или бактериальной природы, противоопухолевых и антипаразитарных вакцин.

Предпринимаемые попытки выделения из Quil А фракции более очищенных сапонинов с низкими цитотоксическими свойствами приводят к тому, что полученные сапонины либо не образуют структуры в виде ИСКОМ, либо не обладают необходимой иммуностимулирующей активностью.

Техническим результатом заявляемого решения является получение носителя антигенов, имеющего высокую иммунологическую эффективность в составе субъединичных вакцин и характеризующегося отсутствием токсичности, воспалительных и болевых реакций при применении.

Технический результат обеспечивается получением носителя антигенов в виде липидного комплекса, состоящего из гликозида, холестерина и липида; в качестве гликозида комплекс содержит голотоксин А₁, а в качестве липида моногалактозилдиацилглицериды (МГДГ) из морских макрофитов.

Технический результат оптимальным образом достигается получением носителя антигенов в виде липидного комплекса, в котором весовое содержание голотоксина А₁ к холестерину постоянно и равно 3:2, а весовое содержание моногалактозилдиацилглицеридов (МГДГ) из морских макрофитов может изменяться в интервале (2-6).

Полученный липидный комплекс имеет вытянутую нитевидно-тубулярную структуру с длиной частиц от 200 до 300 нм при диаметре тубул около 20 нм, которая отлична от структуры известных иммуностимулирующих комплексов.

Впервые получен носитель антигенов, обладающий высокими иммунологическими и инкорпорирующими характеристиками в отношении амфифильных антигенов, который обеспечивает повышение безопасности вакцин и характеризуется тем, что при его применении достигается снижение токсичности голотоксина A₁, входящего в состав комплекса.

Заявляемый носитель антигенов получают посредством смешения голотоксина А₁, холестерина и МГДГ, взятых в весовом соотношении 3:2:(2-6) в следующем порядке: смешивают растворы холестерина и МГДГ в хлороформе при весовом соотношении холестерина и МГДГ 2:(2-6), упаривают под вакуумом до удаления хлороформа и добавляют 3 весовые части 0,4 процентного водного раствора голотоксина А₁; смесь солюбилизируют, после чего доводят суммарную концентрацию липидов (холестерина и МГДГ) до 2 мг в 1 мл суспензии фосфатно-солевым буфером при pH 7,2. Указанная концентрация липидов является оптимальной для проведения электронно-микроскопических исследований. Полученную суспензию озвучивают с использованием ультразвукового дезинтегратора в течение 5 минут и оставляют на 2 часа до достижения равновесия в системе (пример 1).

Возможность получения носителя антигенов с особой тубулярной суперструктурой при диаметре тубул около 40 нм впервые показана нами в заявке на изобретение «Способ получения антигенов на основе липидов из морских макрофитов и тритерпенового гликозида кукумариозида» при использовании в качестве тритерпенового гликозида кукумариозида А₂-2 из кукумарии Cucumaria japonica (заявка на изобретение № 2005131645/13(035476) от 12.10.2005 г.).

Заявляемый носитель при разных соотношениях компонентов имеет ультрамикроскопические размеры и вытянутую нитевидно-тубулярную структуру с длиной частиц от 200 до 300 нм при диаметре тубул около 20 нм, что подтверждается данными электронной микроскопии (примеры 2,3, фиг.2, снимки А и Б). На фиг.2 приведены электронные микрофотографии липидного носителя антигенов, включающего: голотоксин A₁:Хол:МГДГ из Zostera marina в весовых соотношениях 3:2:2 (снимок А) и 3:2:6 (снимок Б). Сравнение снимков А и Б на фиг.2 показывает, что изменение весового содержания МГДГ от 2 до 6 при формировании комплекса носителя антигена приводит к образованию хорошо оформленных тубулярных структур.

Показано также, что количество МГДГ из различных морских макрофитов при получении носителя антигенов заявляемым способом не влияет на его морфологические характеристики, если его весовое соотношение к голотоксину А₁ и холестерину изменяется в интервале (2-6), т.е. оптимальным соотношением голотоксина A₁, холестерина и МГДГ является 3:2:(2-6) (примеры 3-6, фиг.2, снимки А-Б).

Обнаружено, что комплексы с похожей структурой, но с образованиями меньшего диаметра, могут формироваться и без добавления МГДГ при разных весовых соотношениях голотоксина А₁ и холестерина (примеры 7, 8). Это явление обнаружено впервые – при использовании в качестве тритерпенового гликозида кукумариозида А₂-2 из кукумарии Cucumaria japonica (заявка на изобретение № 2005131645/13(035476) от 12.09.2005 г.) нами не было зарегистрировано образования комплекса между кукумариозидом А₂-2 и холестерином без добавления липидной матрицы.

На снимках В и Г фиг.2 приведены электронные микрофотографии стерин-гликозидных структур, включающих голотоксин А₁:Хол в весовых соотношениях 4:1 и 3:2, соответственно. На снимках видны структуры, сходные со структурой комплексных образований на снимках А и В; их диаметр практически в два раза меньше, чем при добавлении МГДГ в структуру комплексов, и составляет 10-12 нм. Увеличение количества холестерина приводит к появлению на снимке Г (фиг.2) белых пятен, свидетельствующих об избытке холестерина.

Однако добавление мембранообразующего полярного липида МГДГ усиливает связывание голотоксина А₁ со стерином, вызывая существенное снижение гемолитической активности иммуностимулирующего тритерпенового гликозида (пример 9), а также является необходимым условием для самопроизвольного включения амфифильных по своей природе белковых антигенов наружных мембран микроорганизмов. Эффективное весовое содержание МГДГ в системе голотоксин А₁:Хол:МГДГ находится в диапазоне (2-6). Исследования с модельным поверхностным белком бактериального происхождения показывают, что оптимальное соотношение голотоксина А₁:Хол:МГДГ для эффективного инкорпорирования (более 95%) псевдотуберкулезного порина составляет 3:2:6 (пример 10, фиг.4). На фиг.4 приведено распределение псевдотуберкулезного поринового белка по фракциям после осаждения образцов липид-гликозидных носителей с разным содержанием МГДГ ультрацентрифугированием в фосфатно-солевом буфере.

Снижение содержания МГДГ в комплексе носителя антигенов (менее двух весовых частей) приводит к не полному включению белка в структуру комплекса, а при его увеличении (более 6 весовых частей) не происходит существенного улучшения иммунологических и морфологических характеристик получаемого носителя антигенов.

Примеры 2 и 3 (фиг.2, снимки А, Б) подтверждают, что введение МГДГ в смесь голотоксина A₁ и холестерина в указанных выше соотношениях способствует формированию стабильного липидного комплекса, обладающего необходимыми для антигенного носителя свойствами и имеющего стандартную нитевидно-тубулярную структуру.

Оптимальность весового соотношения голотоксина A₁ и холестерина (3:2) подтверждается данными электронной микроскопии. При таком соотношении наблюдается образование видимых электронных микроскопических комплексов. Увеличение содержания голотоксина A₁ в составе носителя антигенов не рационально по двум причинам:

– это не приводит к изменению структуры комплекса, но приведет к появлению его гемолитической активности;

– голотоксин A₁ проявляет свое иммуномодулирующее действие в сверхнизких концентрациях.

Таким образом, экспериментально установлено, что заявляемый липид-холестрин-гликозидный носитель антигенов, полученный при весовом соотношении голотоксин А₁:холестерин:МГДГ, равном 3:2:(2-6), имеет оптимальные характеристики и не оказывает токсического действия при внутрибрюшном (в/б) и подкожном (п/к) введении экспериментальным животным (пример 11). По данным электронной микроскопии полученный носитель антигенов имеет вытянутую нитевидно-тубулярную структуру с длиной структурных образований от 200 до 300 нм при диаметре тубул около 20 нм.

₁ (3). Холестерин-агликоновые комплексы также образуют монослой и ориентированы таким образом, что углеводная цепь молекулы голотоксина A₁ экспонирована на внешней стороне носителя (4). Из уровня техники известно, что образование комплекса холестерин-голотоксин А₁ обусловлено взаимодействием холестерина и агликона данного гликозида за счет гидрофобных, ван-дер-ваальсовых связей и -электронов обеих молекул.

Молекулы МГДГ формируют внутренний монослой комплекса за счет гидрофобного взаимодействия жирнокислотных цепей соседних молекул гликолипидов. Сформировавшийся монослой в свою очередь взаимодействует с агликон-холестериновым монослоем, стабилизируя полученную в итоге структуру.

Предположительным механизмом присоединения поринового антигена к заявляемому комплексу является взаимодействие его гидрофобных участков с гидрофобным матриксом носителя.

Голотоксин A₁ получают из доступного природного сырья – промысловой голотурии, дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus S. [Еляков Г.Б., Мальцев И.И., Калиновский А.И., Стоник В.А. Строение Голотоксина А₁

Получаемое сырье включает сумму тритерпеновых гликозидов, основным компонентом которого является голотоксин A₁; его структурная формула приведена на фиг.3 А.

Голотоксин A₁ в низких дозах обладает адъювантной активностью, оказывая стимулирующее действие на развитие иммунного ответа в разных популяциях иммунокомпетентных клеток при пероральном и парентеральном введении в организм животных. В условиях in vitro голотоксин A₁ изменяет функциональную активность иммунокомпетентных клеток, вызывает усиление бластогенеза лимфоцитов селезенки и цитотоксическую активность макрофагов крови. Макрофаги, активированные голотоксином А₁

Голотоксин A₁ относится к типичным мембранотропным веществам. Мембранная активность голотоксина A₁

Таким образом, использование голотоксина A₁ в комплексе с холестерином позволяет увеличить эффективность противовирусных вакцин, а именно: повысить иммуногенность антигенной субстанции вследствие корпускулярного представления антигенов в структуре носителя, обладающего иммунными свойствами, а также исключить гемотоксичность голотоксина A₁ за счет прочного связывания гликозида с холестерином.

Вне зависимости от источника выделения МГДГ из морских макрофитов полученные препараты представляют собой водную суспензию липидного комплекса, имеющего нитевидно-тубулярную структуру длиной 200-300 нм при диаметре тубул около 20 нм.

Этот липид является самым ненасыщенным гликоглицеролипидом и включает широкий спектр полиеновых жирных кислот. Из уровня техники известно влияние ненасыщенных жирных кислот, в частности линоленовой и арахидоновой, на состояние мембран клеток иммунной системы, в особенности макрофагов.

Эффективность использования МГДГ в качестве липида при формировании носителей антигенов, имеющих тубулярную структуру, исследована и обоснована нами в заявке на изобретение 2005131645/13(035476) от 12.10.2005 г. В заявке показано, что МГДГ проявляет самостоятельную иммуноадьювантную активность при в/б и п/к введении, сопоставимую с активностью адъюванта Фрейнда и даже превосходящую его при иммунизации корпускулярным Т-зависимым антигеном – эритроциты барана (ЭБ); обладает способностью подавлять активность эффекторов гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

Следует отметить, что новые функции голотоксина А₁ и МГДГ, которые они проявляют в заявляемом изобретении, не вытекают с очевидностью из известных для них свойств.

На основе голотоксина А₁, холестерина и МГДГ впервые получен носитель антигенов, имеющий нитевидно-тубулярную структуру, позволяющую увеличить эффективность противовирусных вакцин, а именно: повысить иммуногенность антигенной субстанции вследствие корпускулярного представления антигенов в структуре липид-гликозидного носителя, обладающего иммунными свойствами, а также исключить гемотоксичность за счет прочного связывания гликозида с мембранообразующими липидами – холестерином и МГДГ в структуре липид-гликозидного матрикса (пример 9).

Подлинность препарата определяется качественным и количественным составом структурных компонентов (голотоксина A₁, холестерина и МГДГ), являющихся исходными при получении носителя антигенов; его структура подтверждается данными электронной микроскопии (фиг.2, снимки А, Б). Препарат стабилен при температуре (-4°С) более трех месяцев.

Предлагаемый липид-гликозидный комплекс при подкожном и внутрибрюшинном введении мышам не вызывает воспалительных, болевых, токсических, а также высоких цитолитических эффектов (пример 11).

Возможность осуществления изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Приготовление препарата липид-гликозидного носителя, состоящего из голотоксина A₁, холестерина и МГДГ.

Приготовление растворов исходных компонентов проводят следующим образом: 5 мг МГДГ растворяют в 1 мл хлороформа и 5 мг холестерина растворяют в 1 мл хлороформа, 4 мг голотоксина A₁ растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Микродозатором отбирают необходимое количество растворенного в хлороформе холестерина и МГДГ, упаривают под вакуумом и солюбилизируют сухой остаток 0,4% раствором голотоксина А₁. После тщательного перемешивания в смесь добавляют солевой фосфатный буфер, pH 7,2, до конечной концентрации липидов в смеси 2 мг в 1 мл. Полученную суспензию озвучивают ультразвуковым дезинтегратором SONOPULS Ultraschall – Homogenizatoren HD 2070 (Германия) при частоте 20 кГц, мощность 7 Вт в режиме 7 (0,7 с работа, 0,3 с перерыв) в течение 5 минут, и затем выдерживают в течение 2 часов до полного формирования комплексов.

Пример 2. Приготовление препарата липид-гликозидного носителя, состоящего из трех весовых частей голотоксина A₁, двух весовых частей холестерина и двух весовых частей МГДГ из Zostera marina по описанной в примере 1 методике. Микродозатором отбирают 200 мкл раствора холестерина и 200 мкл раствора МГДГ, упаривают под вакуумом досуха и солюбилизируют сухой остаток 0,4% раствором голотоксина А₁, объем которого составляет 375 мкл. После тщательного перемешивания в смесь добавляют 625 мкл солевого фосфатного буфера, pH 7,2. Конечная концентрация липидов составляет 2 мг в 1 мл. Суспензию озвучивают 5 минут на ультразвуковом дезинтеграторе. Полученный препарат представляет собой водную суспензию, включающую частицы носителя, имеющего ультрамикроскопическую тубулярную липидную структуру с длиной тубул 100-300 нм. На фиг.2 (снимок А) приведена электронная микрофотография, полученного липид-гликозидного носителя (увеличение Х 50000).

Пример 3. Препарат липидного носителя получали по описанной в примере 1 методике при весовом соотношении исходных компонентов 3:2:6 с использованием МГДГ из Zostera marina. На фиг.2 (снимок Б) приведена электронная микрофотография липидного носителя, полученного с использованием МГДГ из Zostera marina (увеличение Х 50000).

Пример 4. Препарат липидного носителя получали по описанной в примере 3 методике с использованием МГДГ из Ulva fenestrate. Использование МГДГ, выделенного из Ulva fenestrate не изменяло морфологию носителя.

Пример 5. Препарат липидного носителя получали по описанной в примере 3 методике с использованием МГДГ из Ahnfeltia tobuchiensis. Использование МГДГ, выделенного из Ahnfeltia tobuchiensis, не изменяло морфологию носителя.

Пример 6. Препарат липидного носителя получали по описанной в примере 3 методике с использованием МГДГ из Laminaria japonica. Использование МГДГ, выделенного из Laminaria japonica, не изменяло морфологию носителя.

Пример 7. Препарат гликозид-стеринового комплекса получали по описанной в примере 1 методике на основе голотоксина A₁ и холестерина при их весовом соотношении 4:1 без добавления МГДГ. По данным электронной микроскопии голотоксин A₁ в присутствии холестерина и в отсутствии МГДГ формирует нитевидные структуры длиной 100-200 нм. На фиг.2 (снимок В) приведена электронная микрофотография гликозид-стеринового комплекса, полученного в условиях примера 4 (увеличение Х 50000).

Пример 8. Препарат гликозид-стеринового комплекса получали по описанной в примере 1 методике на основе голотоксина A₁ и холестерина при их весовом соотношении 3:2 без добавления МГДГ. По данным электронной микроскопии голотоксин A₁ в отсутствии МГДГ и в избытке холестерина формирует нитевидные структуры. На фиг.2 (снимок Г) приведена электронная микрофотография гликозид-стеринового комплекса, полученного в условиях примера 5 (увеличение Х 50000).

Пример 9. Липидные носители, приведенные в примерах 2 и 3, тестировали на гемолитическую активность в условиях in vitro с использованием в качестве тест-системы эритроцитов беспородных мышей. Гепаринизированную кровь, полученную путем декапитации мыши, промывали в изотоническом растворе хлорида натрия 2-кратным центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре. Из осадка эритроцитов получали 0,5% клеточную суспензию. Исследуемые препараты готовили в фосфатно-солевом буфере, pH 7,4, и последовательно разносили по 10 мкл по лункам планшета методом двукратных серийных разведений с последующим добавлением суспензии эритроцитов по 90 мкл на лунку. В контрольные лунки добавляли по 10 мкл фосфатно-солевого буфера. Инкубирование проводили в течение 1 и 2 часов в термостате при 37°С. Оценку гемолитической активности исследуемых препаратов производили при визуальном осмотре лунок. Минимальную эффективную дозу вещества, вызывающую 100% гемолиз (ЕД₁₀₀), определяли по появлению прозрачного раствора «лаковой» крови.

Гемолитическое действие голотоксина F₁, включенного в комплекс заявляемого носителя антигенов, по отношению к эритроцитам белой мыши в течение двух часов наблюдения в составе липидных носителей снижалось в 9,8 раз по сравнению с действием того же количества индивидуального тритерпенового гликозида.

Пример 10. Полученные по описанной в примере 1 методике препараты липидных носителей смешивали с 0,6 мг псевдотуберкулезного поринового белка. Весовые соотношения структурообразующих компонентов голотоксин А₁:Хол:МГДГ составляли 3:2:2, 3:2:6 или 3:2:10. При этом содержание голотоксина во всех исследованных препаратах было постоянно и составляло 0,6 мг. После ультразвукового дезинтегрирования белоксодержащие образцы носителей осаждали на ультрацентрифуге со скоростью 45000×g в течение 30 мин. Из центрифужных пробирок, сверху вниз до осадка, отбирали 12 фракций и в каждой определяли содержание белка по методу Лоури.

В результате эксперимента было показано (фиг.4), что более 95% белка после перемешивания и ультразвуковой обработки включается в состав липидных носителей, содержащих голотоксин A₁, холестерин и МГДГ в соотношении 3:2:(6-10). Снижение количества МГДГ в 3-5 раз приводит к частичной утрате инкорпорирующих свойств носителя.

Пример 11. Полученный заявляемым способом (пример 2, 3) липидный носитель антигенов был испытан на группе беспородных мышей (по 10 в контрольной и опытной группе) на его безопасность. В ходе наблюдения у животных контролировали появление воспалительных или болевых реакций, признаков токсичности или гибели.

Однократное внутрибрюшинное введение белым беспородным мышам препарата липидного носителя из расчета 100 и 200 мкг голотоксина A₁ на мышь не вызывает гибели животных и проявления токсических эффектов в течение трех дней наблюдения. Испытываемые дозы голотоксина A₁ соответствуют 5 и 10 мкг/кг веса. При этом оптимальная иммунотропная доза голотоксина A₁ составляет 0,05-50 мкг на 1 кг веса.

Однократное подкожное введение липидных комплексов, приведенных в примерах 2 и 3, из расчета 100 и 200 мкг голотоксина A₁ на мышь, не вызывает воспалительных и болевых эффектов у животных в течение трех дней наблюдения.

Формула изобретения

Носитель антигенов в виде липидного комплекса, состоящий из гликозида, холестерина и липида, отличающийся тем, что в качестве гликозида он содержит голотоксин A₁, а в качестве липида-моногалактозилдиацилглицериды (МГДГ) из морских макрофитов, взятые в весовом соотношении 3(голотоксин А₁):2(холестерин):(2-6) (МГДГ) и представляет собой вытянутую нитевидно-тубулярную структуру.

РИСУНКИ