Патент на изобретение №2322254

(54) ЖИДКИЙ ПРЕПАРАТ, СОДЕРЖАЩИЙ ОЛИГОПЕПТИДЫ И ЭТЕРИФИЦИРОВАННЫЙ ЦИКЛОДЕКСТРИН

(57) Реферат:

Изобретение относится к фармацевтической композиции, которая включает препарат олигопептидов, включающий олигопептид формулы I цикло-(n-Arg-nGly-nAsp-nD-nE) и этерифицированный -циклодекстрин, а также к способу получения водного фармацевтического препарата. Изобретение обеспечивает значительное повышение растворимости олигопептида, а также стабильность препарата на протяжении относительно длительного периода времени. 2 н. и 11 з.п. ф-лы. 6 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”41(12):874-6. Johnson MD et al. “Solubilization of a tripeptid HIV protease inhibitor using a combination of ionization and complexation with chemically modified cyclodextrin”, J Pharm Sci, 1994 Aug; 83(8):1142-6.

Настоящее изобретение относится к жидкому фармацевтическому препарату олигопептидов формулы I, который содержит олигопептид и этерифицированный -циклодекстрин, имеющий растворимость, большую чем 1,8 мг/мл воды, а также к приготовлению жидкого фармацевтического препарата.

Олигопептиды, которые содержатся в препарате в соответствии с изобретением, представляют собой циклопептиды формулы I

где

D и Е каждый независимо друг от друга обозначает Gly, Ala, -Ala, Asn, Asp, Asp(OR), Arg, Cha, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Lys(Ac), Lys(AcNH₂), Lys(AcSH), Met, Nal, Nle, Orn, Phe, 4-Hal-Phe, гомо-Phe, Phg, Pro, Pya, Ser, Thr, Tia, Tic, Trp, Tyr или Val, где указанные аминокислотные радикалы могут также быть дериватизованы,

R обозначает алкил, содержащий 1-18 атомов С,

Hal обозначает F, Cl, Br или I,

Ас обозначает алканоил, содержащий 1-10 атомов С, ароил, содержащий 7-11 атомов углерода, или аралканоил, содержащий 8-12 атомов С,

n обозначает атом водорода или алкильный радикал R, бензил или аралкильный радикал, содержащий 7-18 атомов С в альфа-аминогруппе соответствующего аминокислотного радикала,

при условии, что, по крайней мере, один аминокислотный радикал имеет заместитель n, где n обозначает R, и где, если они представляют собой радикалы оптически активных аминокислот и производных аминокислот, то включаются обе формы D и L, а также их физиологически приемлемые соли.

Олигопептиды формулы I описаны в ЕР 0770622 А2. Ссылка на это описание дается в отношении значимости аминокислот и заместителей, которые присутствуют в формуле I, а также препарата пептидов.

Олигопептиды формулы I действуют как ингибиторы интегрина, ингибируя, в частности, взаимодействие рецепторов ₃– или ₅-интегрина с эндогенными лигандами. Соединения демонстрируют активность против интегринов _v3, _v5, _v6 и _II3, a также против рецепторов _v1 и _v8. Блокада рецепторов _v3 и _v6 представляет собой в данном случае особую важность. В частности, в данной заявке будет упомянуто предотвращение стимуляции рецепторов _v3 с помощью эндогенного лиганда фибриногена.

Описанные взаимодействия приводят, в частности, к ингибированию ангиогенеза, делая тем самым олигопептиды приемлемыми для раковой терапии. Особое внимание уделяется в данной заявке олигопептиду циленгитиду, циклическому пентапептиду, который имеет химическое обозначение цикло-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMe-Val). Циленгитид уже находится на втором этапе клинических исследований для лечения раковых заболеваний.

Подобно другим пептидам олигопептиды формулы I преимущественно вводятся парентерально в виде водного раствора. Для их терапевтического использования, таким образом, необходимы водные растворы олигопептида. Водные растворы олигопептида, которые используются для этих целей, должны быть подобраны в соответствии с особыми терапевтическими требованиями, в частности они должны включать активный ингредиент в количестве, необходимом для терапии, а также должны иметь достаточный период хранения.

Лечение опухолевых заболеваний требует парентерального введения относительно больших количеств активного ингредиента. Благодаря своей пептидной структуре, олигопептиды имеют относительно хорошую растворимость в воде. Однако относительно высокие количества активного ингредиента, необходимые для терапии, приводят к относительно высоким объемам раствора активного ингредиента, которые вводятся парентерально. Такие растворы не могут больше вводиться с помощью простой инъекции, вместо этого они должны вводится путем инфузии.

Циленгитид, например, имеет растворимость насыщения в физиологическом растворе приблизительно 19 мг/мл и может, таким образом, использоваться для терапевтического применения, может безопасно использоваться парентерально в концентрации 15 мг/мл, такое количество растворяют в физиологическом растворе. Если, например, для терапии с использованием циленгитида необходима доза 1500 мг, то объем, который вводится, повышается до 100 мл. Объемы такого порядка не могут больше вводиться с помощью инъекции, они должны быть введены с помощью инфузии, что является неблагоприятным.

Для того, чтобы снизить соответствующий объем раствора активного ингредиента, который вводится, желательно повысить содержание активного ингредиента в соответствующем водном растворе. Подобно другим пептидам, растворимость олигопептидов зависит от значения рН соответствующего растворителя. Приемлемой мерой повышения растворимости, таким образом, является, в частности, доведение рН водного растворителя до значения, при котором олигопептид имеет более высокую растворимость. Однако значения рН, которые необходимы для этой цели, находятся за пределами физиологического интервала, который рассматривается как крайне критический при парентеральном введении. Кроме того, значение рН, которое сильно отличается от физиологического рН, обычно приводит к ускоренной деградации пептида в водном растворе, что означает, что растворы этого типа также имеют недостаточный период хранения.

Всесторонние попытки повысить растворимость олигопептидов не принесли желаемого успеха. Например, неудачной была попытка повысить растворимость циленгитида путем прибавления физиологически переносимых органических растворителей, таких как этанол или пропандиол. Прибавление сурфактантов, таких как Кремофор и полисорбат 80, также не обеспечило значительного повышения растворимости циленгитида.

Несмотря на то, что смеси лимонной кислоты, фосфатного буфера и сурфактантов дают возможность повысить растворимость циленгитида, эти растворы, однако, являются нестабильными при хранении.

ЕР 0149197 раскрывает эфиры циклодекстрина, которые способны повысить растворимость в воде слаборастворимых лекарственных средств. В данном случае обсуждаются соединения, которые образуются, при этом лекарственные средства проникают в гидрофобную полость кольцевой системы циклодекстрина. Предварительное условие для способности лекарственного средства проникать в полость заключается в том, чтобы они также приспосабливались к полости. Лекарственные средства, таким образом, не должны превышать определенного пространственного размера. Все лекарственные средства, упомянутые в ЕР 0149197, представляют собой соединения с низким молекулярным весом, при этом они имеют низкую растворимость в воде. В противовес этому рассматриваемые активные ингредиенты представляют собой пептиды, которые имеют относительно высокую растворимость в воде, и в дополнение обладают высоким молекулярным весом и, следовательно, большим пространственным размером.

Задача настоящего изобретения заключалась, таким образом, в том, чтобы обеспечить водный препарат, который имеет повышенное содержание олигопептидов формулы I, который является приемлемым для парентерального введения. Препарат не будет включать каких-либо токсикологически неприемлемых вспомогательных веществ и будет стабильным на протяжении относительно длительного периода времени.

Неожиданно было обнаружено, что препарат, который соответствует этим требованиям, представляет собой форму раствора, который, кроме олигопептида формулы I, включает эфир -циклодекстрина, который имеет растворимость в воде, большую, чем 1,8 мг/мл.

Препарат в соответствии с изобретением может храниться на протяжении периода, по крайней мере, 6 месяцев в стабильном состоянии при температуре холодильника (2-8°С) и даже при комнатной температуре (при 25°С и 60%-ной относительной влажности). Неожиданно было обнаружено, что препарат в соответствии с изобретением может также стабильно храниться при повышенных температурах и уровнях атмосферной влажности, например, в течение 3 месяцев при температуре 30°С и относительной влажности 60% и в течение 4 недель при температуре 40°С и относительной влажности 75%.

-циклодекстрин представляет собой -1,4-связанный циклический олигосахарид, содержащий 7 единиц глюкозы, который имеет растворимость насыщения 1,8 мг/мл в воде при комнатной температуре. Каждая (безводная) глюкозная единица -циклодекстрина содержит свободные гидроксильные группы в положениях 2-, 3- и 6-, при этом каждая из них может быть этерифицирована. Если все или некоторые из свободных гидроксильных групп глюкозы являются этерифицированными с помощью алкильных групп, содержащих одну или более полярных групп, то есть, групп, которые имеют хорошую растворимость в воде, таких, как например, гидроксильная группа, то образуются этерифицированные -циклодекстрины, которые имеют повышенную растворимость в воде по сравнению с чистым -циклодекстрином. Приемлемые гидроксильные группы, которые повышают растворимость в воде, представляют собой, например, группы гидроксиэтила или гидроксипропила, которые могут быть введены в -циклодекстрин с помощью реакции -циклодекстрина с соответствующими алкиленовыми оксидами, такими, как этиленоксид или пропиленоксид. Эфирные заместители, которые присутствуют, предпочтительно представляют собой гидроксиэтильные и/или гидроксипропильные группы.

Водный фармацевтический препарат предпочтительно включает частично этерефицированный -циклодекстрин, т.е. -циклодекстрин, в котором только некоторые гидроксильные группы безводных глюкозных единиц находятся в этерифицированной форме.

В зависимости от количества алкиленоксида, используемого для этерификации относительно -циклодекстрина, образуются этерифицированные -циклодекстрины с различной степенью замещения. Степень замещения на основе замещения эфиром выражают, как описано ниже, как молярную степень замещения (MS), она означает молярное количество алкиленоксида, используемого на моль (безводной) глюкозной единицы.

В соответствии с изобретением частично этерифицированные -циклодекстрины, присутствующие в водном фармацевтическом препарате, имеют молярную степень замещения от 0,2 до 10. Предпочтение отдается этерифицированным -циклодекстринам, которые имеют молярную степень замещения от 0,2 до 2, в частности, предпочтительно тем, которые имеют молекулярную степень замещения от 0,5 до 0,8 и, в частности, предпочтительно имеют молярную степень замещения приблизительно 0,58-0,73.

Олигопептид, присутствующий в водном растворе, в соответствии с изобретением может быть любым из олигопептидов, которые охватываются представленной выше общей формулой I. Олигопептид, присутствующий в водном фармацевтическом препарате, предпочтительно представляет собой предпочтительно цикло-(NMeArg-Gly-Asp-D-Phe-Val), цикло-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal), цикло-(Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Val), цикло-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Val) или цикло-(Arg-Gly-Asp-NMeDPhe-Val). В частности, предпочтительно присутствует циленгитид. Как было уже упомянуто, циленгитид имеет химическое обозначение цикло-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMe-Val).

Если водный препарат еще не является изотоническим благодаря осмотическим свойствам олигопептида и благодаря циклодекстрину, то дополнительно может присутствовать изотонический агент, предпочтительно физиологически приемлемая соль, такая как, например, хлорид натрия или хлорид калия, или физиологически переносимый полиол или сахар, такой как, например, глюкоза, глицерин или маннитол, в количестве, необходимом для установления изотоничности.

Кроме того, водный препарат в соответствии с изобретением может включать также физиологически переносимые вспомогательные вещества, такие как, например, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или глутатион, консерванты, такие как фенол, м-крезол, метил- или пропилпарабен, хлорбутанол, тиомерсал или хлорид бензалкония, или также стабилизаторы, структурообразующие агенты и солюбилизирующие агенты, такие как полиэтиленгликоли (ПЭГ), например ПЭГ 3000, 3350, 4000 или 6000 или декстраны.

Кроме того, водный препарат в соответствии с изобретением может включать буферы, которые в принципе возможно использовать для всех физиологически переносимых веществ, которые являются приемлемыми для установления желаемого значения рН. Любое буферное вещество, которое содержится в буфере, присутствует в концентрации от 5 до 50 ммол/л, предпочтительно в концентрации от 10 до 20 ммол/л. Предпочтительные буферы представляют собой буфер на основе лимонной кислоты или фосфатный буфер. Приемлемые фосфатные буферы представляют собой растворы моно- и/или динатрия и калиевые соли фосфорной кислоты, такие как гидрофосфат динатрия или дигидрофосфат калия, а также смеси солей натрия и калия, такие как, например, смеси гидрофосфата динатрия и дигидрофосфата калия.

Водный препарат преимущественно имеет значение рН от 5 до 8, предпочтительно рН от 5,6 до 7,4, особенно предпочтительно значение рН от 6 до 7,2. Осмоляльность предпочтительно составляет от 250 до 350 мОсмол/кг. Водный препарат может, таким образом, вводиться непосредственно внутривенно или внутриартериально существенно безболезненно.

В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения водный фармацевтический препарат включает от 20 до 120 мг/мл циленгитида и от 15 до 25 мас.% гидроксипропил--циклодекстрина, который имеет молярную степень замещения приблизительно 0,5-0,8.

В соответствии с особенно предпочтительным воплощением изобретения водный фармацевтический препарат включает приблизительно 80 мг/мл циленгитида и приблизительно 20 мас.% гидроксипропил--циклодекстрина, который имеет молярную степень замещения приблизительно 0,58-0,73.

Водный препарат может быть получен путем успешного растворения в воде веществ, которые присутствуют в препарате. Благоприятно, когда сначала циклодекстриновый эфир растворяют в воде, а потом последовательно прибавляют олигопептид и любые другие вспомогательные вещества. Изобретение, таким образом, также касается способа получения водного фармацевтического препарата в соответствии с изобретением, который характеризуется тем, что сначала эфир -циклодекстрина растворяют в воде, а потом последовательно прибавляют активный ингредиент и любые из дополнительных вспомогательных веществ.

Если это является необходимым, то в растворе, содержащем определенный олигопептид, эфир -циклодекстрина и любое из дополнительных вспомогательных веществ, устанавливают значение рН от 5 до 8. Раствор последовательно подвергают фильтрованию в стерильных условиях.

Примеры объясняют изобретение без его ограничения.

Пример 1

Растворимости насыщения олигопептидов в отношении циленгитида

Для того чтобы определить растворимости насыщения, олигопептиды перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре в растворителе, указанном для каждого случая. Результаты представлены в Таблице 1.

Результаты показывают, что растворимость насыщения олигопептида в воде не увеличивалась при прибавлении спиртов этанола и пропандиола, но вместо этого он разлагался. В противовес этому различные смеси буферов в кислом интервале обеспечивали значительное увеличение растворимости насыщения. Если прибавляли сурфактанты к кислым растворам с повышенной растворимостью олигопептида, то это не приводило к дальнейшему повышению растворимости. Если вместо этого или в сочетании с сурфактантами прибавляли глицерин к кислым растворам, наблюдали даже снижение растворимости.

Пример 2

Стабильность выбранных композиций из Примера 1 с высокой растворимостью насыщения для олигопептида

Выбранные композиции, в которых циленгитид имеет высокую растворимость насыщения, хранили в течение 8 и 26 недель при температуре 25°С и 60%-ной относительной влажности, а также при температуре 40°С и 75%-ной относительной влажности и анализировали на содержание в них циленгитида при использовании жидкостной хроматографии под высоким давлением (HPLC-UV) в начале (старт) и в конце периода хранения. Результаты показаны в Таблице 2.

Ни один из препаратов, имеющих концентрации циленгитида 60 мг/мл, не демонстрировал высокую стабильность. Прибавление Кремофора RH 40 или полисорбата 80 VS не приводило к улучшенной стабильности по сравнению с чистыми буферными растворами. Три проанализированных препарата, содержащие 15 мг/мл циленгитида, демонстрировали значительно улучшенную стабильность с изотоническим раствором NaCI, который был наиболее стабильным.

Пример 3

Растворимости насыщения олигопептидов при прибавлении эфиров -циклодекстрина

Аналогично Примеру 1 определяли влияние прибавления эфиров -циклодекстрина (MS 0,63) на растворимости насыщения олигопептидов при использовании циленгитида. Результаты показаны в Таблице 3.

Таблица 3
Композиция	Концентрация циленгитида [мг/мл]	рН
Вода/2-гидроксипропил--циклодекстрин (20%)	>90	7,02 (80 мг циленгитида в 20%-ном 2-гидгроксипропил--циклодекстрина
Вода/2-гидроксипропил--циклодекстрин (15%)	>60
Вода/2-гидроксипропил--циклодекстрин (10%)	>40

Результаты показывают значительное повышение растворимости циленгитида посредством прибавления простых эфиров -циклодекстрина. В противовес добавкам, которые анализировали в Примере 1, увеличение растворимости является прямо пропорциональным концентрации эфира -циклодекстрина.

Пример 4

Водный препарат, включающий:

200 мг 2-гидроксипропил--циклодекстрина (MS 0,63)

80 мг циленгитида

до 1 мл водой для инъекций

Установленное количество 2-гидроксипропил--циклодекстрина растворяли приблизительно в 90% установленного количества воды для инъекций при перемешивании, прибавляли установленное количество олигопептида и после того, как получали осветленный раствор, прибавляли оставшееся количество растворителя. Полученный раствор фильтровали в стерильных условиях, переносили в пробирки на 6 мл, каждая из которых содержала 2 мл раствора, закрывали пробками и закручивали.

Пример 5

Сравнительное изучение стабильности препаратов, включающих олигопептид в изотоническом физиологическом растворе или растворе эфира -циклодекстрина

Препарат в соответствии с Примером 4 и препарат, полученный аналогично и содержащий 15 мг/мл циленгитида в изотоническом физиологическом растворе (0,9% NaCl), подвергали анализу на стабильность. С этой целью водные препараты хранили при различных температурах в течение определенного времени и анализировали при использовании приемлемых аналитических способов. Возможная нестабильность в случае олигопептидов в водном растворе становилась принципиально очевидной из образования измененных и гидролизованных продуктов. В случае циленгитида продукты разложения все еще несли те же хромофоры и подобно исходному материалу могли определяться с помощью HPLC-UV. Результаты показаны в Таблицах 4-6.

Таблица 4 Данные относительно стабильности при температуре 2-8°С в течение 26 недель
Состав	Концентрация циленгитида [мг/мл] (начало)	Циленгитид [%]	Чистота 1 [%]*	Чистота 2 [%]	Чистота 3 [%]
Изотонический NaCl	15 мг/мл	100,67	0,48 (начало 0,43)	<0,05	<0,05
2-гидроксипропил--циклодекстрин	80 мг/мл	99,13	<0,05	<0,05	<0,05
*Чистота 1 указана при максимальном значении 2%

Таблица 5 Данные относительно стабильности при 25°С/60%-ной относительной влажности в течение 26 недель
Композиция	Концентрация циленгитида [мг/мл] (начало)	Циленгитид [%]	Чистота 1 [%]*	Чистота 2 [%]	Чистота 3 [%]
Изотонический NaCl	15 мг/мл	101,26	0,84 (начало 0,43)	0,13	<0,05
2-гидроксипропил--циклодекстрин	80 мг/мл	96,56	0,39	0,14	<0,05

Таблица 6 Данные относительно стабильности при 30°С/60%-ной относительной влажности в течение 26 недель
Композиция	Концентрация циленгитида [мг/мл] (начало)	Циленгитид [%]	Чистота 1 [%]*	Чистота 2 [%]	Чистота 3 [%]
Изотонический NaCl	15 мг/мл	100,82	1,16	0,24	0,06
2-гидроксипропил--циклодекстрин	80 мг/мл	99,37	0,74	0,25	0,08

Несмотря на то, что олигопептид присутствовал в препарате в соответствии с Примером 3 в концентрации, которая более, чем в 5 раз превышала таковую в препарате изотонического физиологического раствора, препарат в соответствии с Примером 3, включающий эфир -циклодекстрина, имел стабильность, подобную таковой для препарата в изотоническом физиологическом растворе.

Способы аналитической проверки

Внешний вид

Полученные препараты визуально проверяли на наличие частичек при использовании источника света против темной стенки, как описано в Ph. Eur.

Анализ и определение чистоты циленгитида

Анализ и определение чистоты осуществляли с помощью способа HPLC-UV при длине волны 215 нм. Фазу RP 18 использовали для разделения. Используемый элюент представлял собой буфер с рН 3,6, который включал дигидрофосфат натрия и фосфорную кислоту, которые перемешивали в одинаковых пропорциях с ацетонитрилом. Осуществляли градиентное элюирование при различных соотношениях дополнительного ацетонитрила.

Формула изобретения

1. Водная фармацевтическая композиция, включающая олигопептид формулы I

D и Е каждый независимо друг от друга обозначает Gly, Ala, -Ala, Asn, Asp, Asp(OR), Arg, Cha, Cys, Gin, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Lys(Ac), Lys(AcNH₂), Lys(AcSH), Met, Nal, Nle, Orn, Phe, 4-Hal-Phe, Homo-Phe, Phg, Pro, Pya, Ser, Thr, Tia, Tic, Trp, Туг или Val, где указанные аминокислотные радикалы могут также быть дериватизованы,

R обозначает алкил, содержащий 1-18 атомов С,

Hal обозначает F, Cl, Br или I,

Ас обозначает алканоил, содержащий 1-10 атомов С, ароил, содержащий 7-11 атомов углерода, или аралканоил, содержащий 8-12 атомов С,

n обозначает атом водорода или алкильный радикал R, бензил или аралкильный радикал, содержащий 7-18 атомов С в альфа-аминогруппе соответствующего аминокислотного радикала,

при условии, что, по крайней мере, один аминокислотный радикал имеет заместитель n, где n обозначает R,

и где, если они представляют собой радикалы оптически активных аминокислот и производных аминокислот, то включаются обе формы D и L, а также их физиологически приемлемые соли, и этерифицированный -циклодекстрин, который имеет растворимость в воде, которая больше, чем 1,8 мг/мл воды.

2. Водная фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что этерифицированный -циклодекстрин присутствует как частично этерифицированный -циклодекстрин.

3. Водная фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что заместители простого эфира в этерифицированном -циклодекстрине представляют собой гидроксиэтильные и/или гидроксипропильные группы.

4. Водная фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что этерифицированный -циклодекстрин имеет степень молярного замещения от 0,2 до 10.

5. Водная фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что частично этерифицированный -циклодекстрин имеет степень молярного замещения от 0,2 до 2 на основе эфирных заместителей.

6. Водная фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что частично этерифицированный -циклодекстрин имеет степень молярного замещения от 0,5 до 0,8 на основе эфирных заместителей.

7. Водная фармацевтическая композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что олигопептид представляет собой циленгитид.

8. Водная фармацевтическая композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что дополнительно присутствует изотонический агент в количестве, необходимом для установления изотоничности.

9. Водная фармацевтическая композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что она имеет значение рН от 5 до 8, предпочтительно значение рН от 5,6 до 7,4.

10. Водная фармацевтическая композиция по п.9, отличающаяся тем, что она имеет значение рН от 6 до 7,2.

11. Водная фармацевтическая композиция по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что она включает от 20 до 120 мг/мл циленгитида и от 15 до 25 мас.% гидроксипропил--циклодекстрина, который имеет молярную степень замещения от 0,5 до 0,8.

12. Водная фармацевтическая композиция по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что она включает приблизительно 80 мг/мл циленгитида и приблизительно 20 мас.% гидроксипропил--циклодекстрина, который имеет молярную степень замещения приблизительно 0,58-0,73.

13. Способ получения водной фармацевтической композиции по пп.1-12, отличающийся тем, что сначала эфир -циклодекстрина растворяют в воде и после этого прибавляют активный ингредиент и любые другие вспомогательные вещества.