Патент на изобретение №2321353

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЦИРРОТИЧЕСКОЙ СТАДИИ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, в частности гепатологии и инфекционным болезням, и может использоваться при диагностике цирротической стадии хронического вирусного гепатита. Проводят морфологическое исследование ткани печени и определяют экспрессию альфа-гладкомышечного актина (-SMA) в ядрах гепатоцитов и при ее отсутствии диагностируют цирротическую стадию хронического вирусного гепатита. Способ является универсальным и позволяет осуществлять диагностику в условиях малого количества материала исследования, а также при получении образца ткани из крупного узла печени при крупноузловом циррозе (не содержащим вовлеченных в цирротический процесс портальных трактов). Кроме того, он повышает точность диагностики цирротической стадии хронического вирусного гепатита по сравнению с прототипом до 65%. 6 ил., 2 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”R. et al. Chronic hepatitis С in alcoholic patients: prevalence, genotypes, and correlation to liver disease. Scand. J. Gasrtoenterol, 1995, 30: 1113-1118.

Изобретение относится к области медицины, в частности гепатологии и инфекционным болезням, и может использоваться при диагностике цирротической стадии хронического вирусного гепатита (ХВГ) иммуногистохимическим методом в условиях малого количества материала исследования (ткани печени, полученной при биопсии печени), а также при получении образца ткани из крупного узла печени при крупноузловом циррозе (не содержащим вовлеченных в цирротический процесс портальных трактов).

Набор клинико-биохимических симптомов и синдромов, имеющихся в арсенале практического врача, не позволяет осуществить раннюю диагностику цирротической стадии ХВГ на этапе компенсации. Это связано с особенностями характера течения цирротической стадии хронического вирусного гепатита. До 40% больных циррозом печени (ЦП) в течение длительного времени не предъявляют никаких жалоб и у них сохраняется бессимптомное течение болезни. Развитие осложнений (асцит, кровотечение из варикозно-расширенных вен пищевода или энцефалопатия) свидетельствует о наступлении декомпенсированной стадии цирроза печени, что не вызывает затруднений в диагностике. В этих случаях 5-летняя выживаемость наблюдается у 50% больных, из них у 70% летальный исход непосредственно связан с поражением печени. При отсутствии симптомов цирроз может быть впервые установлен при случайном клиническом обследовании или на аутопсии [1].

Инструментальные методы исследования (УЗИ, фиброэзофагогастроскопия, радиоизотопное исследование, компьютерная томография) служат главным образом для выявления портальной гипертензии при циррозе печени (асцит, варикозно-расширенные вены пищевода, увеличение селезенки, расширение воротной и селезеночной вен, снижение скорости портального кровотока) [2]. Однако это касается, в основном, осложненных форм цирроза печени.

По наиболее близкой технической сущности в качестве прототипа выбран способ диагностики цирротической стадии хронического вирусного гепатата, заключающийся в морфологическом исследовании ткани печени с использованием полуколичественного метода по V.J.Desmet [3]. Ткань печени фиксируется в 10% нормальном растворе формалина, подвергается проводке в восходящих спиртах, заливается в парафин. Из полученных парафиновых блоков при помощи микротома изготавливаются срезы ткани печени толщиной до 0,5 мкм, помещаются на предметные стекла, окрашиваются пикрофуксином по Ван-Гизону. Изготовленные гистологические препараты изучаются в световом микроскопе, на основании характерных изменений делается заключение о характере и степени выраженности фиброза в печени. Полуколичественная оценка стадии заболевания (степень выраженности и распростраценности фиброза – от отсутствии фиброза до цирроза) осуществляется путем вычисления гистологического индекса стадии заболевания (ГИС по Desmet).

Существенным недостатком данного способа является, во-первых, невозможность его использования при получении малого количества биопсийного материала. Скудность биопсийного материала предполагает недостаточное количество портальных трактов и печеночных долек, что препятствует объективной оценке степени тяжести фиброза в печени, особенно ее конечной стадии – цирроза. Во-вторых, биопсия печени, в силу так называемых «ошибок попадания» может давать ложное представление о характере изменений в печени. Это может быть связано с прохождением биопсийной иглы через участки, не отражающие общую морфологическую картину печени, что обусловливает вариабельность получаемого образца от 15 до 65% от истинного состояния [4].

Задачей изобретения является разработка универсального способа диагностики цирротической стадии хронического вирусного гепатита, позволяющего повысить точность способа за счет возможности проведения диагностики в тех случаях, когда оценка, полученная при использовании способа-прототипа, является недостоверной.

Поставленная задача решается тем, что проводят морфологическое исследование ткани печени, полученной путем биопсии, и оценивают экспрессию альфа-гладкомышечного актина (-SMA) в ядрах гепатоцитов и при ее отсутствии диагностируют цирротическую стадию хронического вирусного гепатита.

Способ осуществляют путем проведения морфологического исследования фрагмента ткани печени, полученного при биопсии. Срезы, изготовленные из проведенного через восходящие спирты, залитого в парафин кусочка ткани печени, после предварительной обработки протеолитическими ферментами для демаскировки антигена инкубируют с мышиными моноклональными антителами к альфа-гладкомышечному актину (-SMA в разведении 1/50, Novokastra, Lab., UK). Выявление реакции антиген-антитело (экспрессия -SMA) в срезе ткани печени осуществляют при помощи иммуногистохимической авидин-биотин-пероксидазной системы визуализации. При помощи светооптического микроскопа оценивают экспрессию -SMA в ядрах гепатоцитов.

Существенным отличительным признаком заявляемого способа является оценка экспрессии альфа-гладкомышечного актина (-SMA) в ядрах гепатоцитов и осуществление диагностики цирротической стадии хронического вирусного гепатита при ее отсутствии, что позволит диагностировать цирротическую стадию хронического вирусного гепатита и в тех случаях, когда общепринятыми методиками невозможно осуществить диагностику, что значительно повысит точность способа.

Звездчатые клетки печени играют важную роль в патогенезе цирроза печени. В здоровой печени их функция заключается в накоплении запасов витамина А. При повреждении печени звездчатые клетки претерпевают активацию и трансдифференцировку в миофибробластоподобные клетки. Этому изменению фенотипа сопутствуют значительные функциональные изменения, включающие изменения продукции и деградации внеклеточного матрикса. В отличие от покоящихся клеток, активированные звездчатые клетки проявляют выраженную иммунореактивность на гладкомышечный актин альфа (-SMA), что свидетельствует о запуске процесса фиброгенеза [5]. Описано 6 главных изоформ актина, 4 из которых (-кардиальный, -актин скелетных мышц, – и -гладкомышечный) экспрессированы исключительно в мышечной ткани. Другие 2 не мышечных актина (– и -цитоплазматические) имеются в клетках практически всех типов. Преобладающей изоформой мышечного актина в мезенхимальных клетках печени является -гладкомышечная изоформа [6]. В мировой литературе описана экспрессия -SMA в не паренхиматозных клетках печени. Согласно современным представлениям в патогенезе фиброгенеза гепатоцитам отводится роль активатора звездчатых клеток продуктами повреждения (активированный кислород, TNF- и т.д.). Существуют единичные упоминания о способности гепатоцита при хроническом повреждении печени продуцировать коллаген, TGF [7, 8, 9].

Неожиданным фактом было обнаружение экспрессии -SMA в ядрах гепатоцитов. В литературе нет свидетельств отмеченного явления. Нами впервые выявлена закономерная экспрессия -SMA в ядрах гепатоцитов в печени больных хроническими формами вирусного гепатита, причем наибольшая интенсивность экспрессии -SMA в ядрах гепатоцитов наблюдалась на ранних стадиях заболевания. В цирротической стадии хронического вирусного гепатита экспрессии -SMA в ядрах гепатоцитов выявлено не было.

Клинические примеры. Пример 1. Больной К., 19 лет. И/б № 24141. Больной поступил в инфекционное отделение с жалобами на утомляемость, слабость, дискомфорт в верхней части живота. При физикальном обследовании – умеренная гепатомегалия. В общем анализе крови – ускоренное СОЭ (33 мм/час); биохимия крови АлАТ-10N, билирубин 32 ммоль/л. Данные серологических исследований: HBsAg, анти-HBcorAg IgM. Полимеразная цепная реакция в биоптате печени на ДНК HBV положительная. Биопсия печени: высокая некровоспалительная активность вирусного гепатита (индекс гистологической активности -ИГА по Knodell 13 баллов), резкое расширение портальных трактов за счет фиброза, формирование завершенных и незавершенных порто-портальных соединителыютканных септ (ГИС по Desmet 14 баллов) (Фиг.1. Формирование фиброзных порто-портальных септ при хроническом гепатите В с тяжелым фиброзом. Ув. × 400. Окр. пикрофуксином по Ван-Гизон). При иммуногистохимическом исследовании выявлена слабая экспрессия гладкомышечного актина в ядрах гепатоцитов (% SMA-позитивных ядер гепатоцитов 0,05) и умеренная экспрессия в звездчатых клетках (% SMA-позитивных звездчатых клеток 0,25) (Фиг.2. Слабая экспрессия -SMA в ядрах гепатоцитов при хроническом гепатите В с тяжелым фиброзом. Ув. × 400. Иммуногистохимический метод).

Больному поставлен диагноз: хронический вирусный гепатит В, фаза репликации, высокая гистологическая активность (ИГА по Knodell – 13 баллов), стадия тяжелого фиброза по Desmet).

Пример 2. Больной С., 62 года, И/б № 24467. Больной поступил в реанимационнное отделение инфекционной больницы с клинической картиной кровотечения из верхних отделов желудочно-кишечного тракта. При осмотре – признаки декомпенсации портальной гипертензии (напряженный асцит, признаки энцефалопатии, варикозное расширение вен пищевода с продолжающимся кровотечением по данным фиброэзофагогастродуоденоскопии). В показателях периферической крови гемоглобин 80 г/л, лейкоцитов – 3,5 тыс., СОЭ – 45 мм/час. Биохимия крови: АлАТ – 2.5 N, билирубин 29 ммоль/л. Спустя несколько часов после поступления наступила смерть при явлениях продолжающегося кровотечения. При проведении постмортального гистологического исследования выявлены изменения архитектоники печени за счет образования грубых порто-портальных и порто-центральных фиброзных септ с формированием ложных печеночных долек (Фиг.3. Разрастание фиброзной ткани, изменение архитектоники печени при цирротической стадии хронического гепатита В. Ув. × 400. Окр. пикрофуксином по Ван-Гизон). Полимеразная цепная реакция в биоптате печени на ДНК HBV положительная. Иммуногистохимически – констатировано полное отсутствие экспрессии гладкомышечного актина в ядрах гепатоцитов при умеренном его содержании в звездчатых клетках (% SMA-позитивных звездчатых клеток 0,39) (Фиг.4. Отсутствие экспрессии -SMA в ядрах гепатоцитов при цирротической стадии хронического гекпатита В. Ув. × 400. Иммуногистохимический метод).

Диагноз: цирроз печени В, фаза репликации, стадия декомпенсации. Осложнения портальной гипертензии: асцит, кровотечение из варикозно-расширенных вен пищевода.

Пример 3. Больной Р., 17 лет, И/б № 4793. Больной поступил в инфекционное отделение для обследования по поводу случайного обнаружения поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Жалоб не предъявлял. В результате обследования выявлены незначительная гепатомегалия. Показатели периферической крови без изменений. В биохимии крови – билирубин 21 ммоль/л, АлАТ 1,5 N. Данные серологических исследований: HBsAg, анти-HBcorAg IgG. Полимеразная цепная реакция в биоптате печени на ДНК HBV отрицательная. Гистологически выявлены минимальные некровоспалительные изменения (ИГА по Knodell 2 балла) паренхимы печени при слабо выраженном фиброзе (ТИС по Desmet 5 баллов). Иммуногистохимически отмечена выраженная экспрессия гладкомышечного актина в ядрах гепатоцитов (% SMA-позитивных ядер гепатоцитов 1,3) при умеренном содержании его в звездчатых клетках (% SMA-позитивных звездчатых клеток 0,17) (Фиг.6. Экспрессия -SMA в звездчатых клетках (а) и ядрах гепатоцитов (б) при хроническом гепатите В со слабо выраженным фиброзом. Ув. × 400. Иммуногистохимический метод).

Диагноз: хронический вирусный гепатит В, нерепликативная фаза с минимальной гистологической активностью (ИГА по Knodell 2 балла), стадия слабого фиброза (ГИС по Desmet 5 баллов).

Представленные клинические примеры иллюстрируют следующее: клинико-биохимические показатели (Пример 1) не позволяют говорить о формировании цирротической стадии. Очевидные признаки портальной гипертензии проявились только на стадии декомпенсации цирротического процесса (Пример 2). Общим объединяющим признаком 1 и 2 клинического примеров является выраженное снижение экспрессии гладкомышечного актина в ядрах гепатоцитов у больного К. (Пример 1) и полное ее отсутствия у больного С. (Пример 2). В случае невозможности гистологической оценки по способу-прототипу в силу получения скудного материала при биопсии печени или “ошибок попадания” заявленный способ позволил бы диагностировать прецирротическую стадию ХВГ.

Уровень экспрессии -SMA в звездчатых клетках как при гепатитах с разной степенью фиброза (клинический пример 1 и 3), так и при ЦП существенно не отличались и практически соответствовали значению этого показателя в нормальной печени контрольного образца (Фиг.5. Экспрессия -SMA в звездчатых клетках (а) и ядрах гепатоцитов (б) контрольном образце ткани печени. Ув. × 400. Иммуногистохимический метод). Следовательно, оценка уровня экспрессии -SMA в звездчатых клетках не соответствует тяжести фиброза.

Наибольшее содержание гладкомышечного актина в ядрах гепатоцитов наблюдалось при ХГ со слабовыраженном фиброзом, существенно превышающим уровень содержания его в нормальной печени.

Таким образом, оценка экспрессии -SMA в ядрах гепатоцитов позволяет диагностировать наступающую цирротизацию процесса.

Нами исследованы 29 фрагментов ткани печени, полученной при помощи слепой чрезкожной пункционной биопсии печени от 29 больных хроническим вирусным гепатитом с разной стадией заболевания, и 10 фрагментов ткани печени, умерших от цирротической стадии хронического вирусного гепатита. Контрольную группу в количестве 5 человек составили пациенты, умершие от заболеваний, не связанных с патологией печени. В данной группе клинико-биохимических и морфологических признаков патологии печени не зафиксировано.

Количественный подсчет выраженности экспрессии -SMA в печеночных дольках осуществлялся путем определения процента -SMA-позитивной площади в 6 полях зрения (по 3 поля из центролобулярных отделов и по 3 поля из парабазальных отделов разных печеночных долек) при помощи компьютерной системы анализа видеоизображений “ВидеоТест Морфология 4.0” (“ИСТА-ВидеоТест”, Россия).

Сравнительный анализ уровня экспрессии -SMA в звездчатых клетках у больных хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени не показал достоверных отличий (таблица 1). Оценка уровня экспрессии -SMA в ядрах гепатоцитов у больных ХГ, ЦП и контрольной группы показала отсутствие экспрессии в ядрах паренхиматозных клеток цирротической ткани при достоверно невысоком содержании белка в ядрах гепатоцитов печени контрольной группы по сравнению с ХГ (таблица 2).

При использовании способа прототипа не всегда возможно достоверно диагностировать цирротическую стадию ХВГ. По литературным данным вариабельность получаемого образца составляет от 15 до 65% от его истинного состояния (4), что связано с получением биопсийного материала, не содержащим вовлеченных в цирротический процесс портальных трактов и печеночных долек, и, тем самым не отражающего общую морфологическую картину печени. Заявляемый способ позволяет и в случаях получения биопсийного материала, не содержаего вовлеченных в цирротический процесс портальных трактов и печеночных долек, достоверно диагностировать цирротическую стадию ХВГ, используя оценку уровня содержания -SMA в ядрах гепатоцитов печени. Следовательно, заявляемый способ повышает точность диагностики по сравнению со способом прототипом от 15 до 65%.

Таблица 1
Уровень экспрессии -SMA в звездчатых клетках печени у больных ХВГ и ЦП
Обследуемая группа	Число больных n	% площади экспрессии -SMA в звездчатых клетках М±m
ХГ	29	0,54±0,07
ЦП	10	0,89±0,30
Контроль	5	0,72±0,28

Таблица 2
Уровень экспрессии -SMA в ядрах гепатоцитов у больных ХВГ и ЦП
Обследуемая группа	Число больных n	% площади экспрессии -SMA в ядрах гепатоцитов М±m
ХГ	29	1,16±0,281,2
ЦП	10	01,3
Контроль	5	0,26±0,172,3
Индекс1 и др. указывают на достоверное различие между сравниваемыми группами (р<0,05)

Литература:

6. Nouchi Т., Tanaka Yu., Tsukada Т. et al. Appearance of

Формула изобретения

Способ диагностики цирротической стадии хронического вирусного гепатита, заключающийся в морфологическом исследовании ткани печени, полученной путем биопсии, отличающийся тем, что оценивают экспрессию альфа-гладкомышечного актина в ядрах гепатоцитов и при ее отсутствии диагностируют цирротическую стадию хронического вирусного гепатита.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 09.12.2007

Извещение опубликовано: 27.07.2009 БИ: 21/2009