Патент на изобретение №2320991

(54) СПОСОБ ИНДИВИДУАЛЬНОГО ПОДБОРА ИММУНОКОРРЕГИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ У БОЛЬНЫХ ПАПИЛЛОМАТОЗОМ ГОРТАНИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к отоларингологии. Сущность способа заключается в том, что после проведенной операции по удалению папилломы гортани у больного производят забор периферической крови, получают лейкоцитарную суспензию, суспензию клеток инкубируют с иммунокоррегирующими препаратами в течение 60 мин при 37°С. Затем производят запись кривых люминолзависимой хемилюминесцентной реакции (ХЛ) и рассчитывают индекс стимуляции препарата (ИС). Препаратом выбора считают иммунокоррегирующий препарат, индекс стимуляции которого больше 1,1. Использование способа позволяет выбрать иммунокоррегирующий препарат с оптимальным влиянием на клетки иммунной системы и исключить применение препаратов, вызывающих индивидуальные реакции подавления функциональной активности нейтрофилов. 2 ил., 2 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к отоларингологии, и предназначено для индивидуального подбора иммунокоррегирующих препаратов при проведении иммунокоррегирующей терапии у больных папилломатозом гортани.

В основе преодоления опухолевыми клетками иммунологического надзора лежат явления, связанные, с одной стороны, с нарушением в работе иммунной системы (врожденные и приобретенные иммунодефициты, возрастное снижение иммунной реактивности), а с другой – с наличием у злокачественно перерожденных клеток механизмов, блокирующих успешное проявление иммунной реактивности [4, 13].

Среди иммунологических факторов, принимающих участие в защите организма от неоплазм, доминирующая роль принадлежит клеточной форме защиты. Наиболее активными клетками в разрушении опухоли являются CD8 (Т-супрессоры) и CD4 (Т-хелперы) Т-клетки. Если CD8 Т-клетки выполняют прямую киллерную функцию, то CD4 Т-клетки способствуют ее успешной реализации. Помощь со стороны Т-хелперов осуществляется через секретируемые цитокины. Среди них наибольшую роль играет интерферон-, который стимулирует макрофаги и увеличивает активность НК клеток (естественных киллеров CD 16) [4, 7, 17].

Состояние иммунодепрессии хорошо известно при онкологических заболеваниях. С этим синдромом связывают механизм опухолевой прогрессии [1].

Однако иммунодепрессия выявляется не только при злокачественных опухолях, но и при доброкачественных – таких как папиллома. Многими исследователями при папилломатозе гортани (ПГ) выявлены нарушения в Т-звене иммунитета, изучены микробиологические и иммунологические аспекты системы антиинфекционной защиты [5, 8, 14].

При папилломатозе угнетение иммунитета обусловлено вирусной инвазией – вирус папилломы человека (ВПЧ) [2, 6, 16].

Нормализация иммунных показателей в этих случаях служит одним из важных факторов в профилактике рецидивов и лечении папиллом гортани.

Основой терапии при папилломатозе гортани остается хирургическое воздействие. С целью улучшения результатов хирургического лечения широкого применения получили иммунотропные препараты.

Однако сложность и множественность механизмов действия иммунокорректоров (ПК) до сих пор не позволяет достаточно глубоко и полно охарактеризовать их роль в развитии иммунных реакций и выработать достаточно обоснованные рекомендации их применения. В связи с этим большое значение приобретает применение индивидуального подхода при проведении иммуномодулирующей терапии. Так, в литературе имеются данные об индивидуальной чувствительности к тому или иному иммунологическому препарату, например, при лечении интерферонами эффективность препаратов в ряде случаев не превышает 50-60% [9, 12, 15]. Однако предложенные на сегодняшний день способы не позволяют объективизировать подбор иммунокорректирующих препаратов и, кроме того, осуществить индивидуальный подбор препарата.

Учитывая это, нами предложена простая и достаточно эффективная методика оценки эффекта лекарственных препаратов на иммунокомпетентные клетки больных папилломатозом гортани, основанная на оценке степени изменения реактивности нейтрофилов периферической крови больного в тесте на люминолзависимую хемилюминесценцию.

Способ осуществляется следующим образом. После проведенной операции по удалению папилломы гортани у больного производили забор периферической крови, затем получали лейкоцитарную суспензию. Для этого 2 мл гепаринизированной крови (25 ЕД/мл) смешивали с 1 мл подогретого до 37°С 3% раствора желатина и инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 мин. После оседания эритроцитов слой плазмы, обогащенный лейкоцитами, отбирали в пластиковые пробирки и отмывали 10-кратным объемом фосфатно-солевого буфера (рН 7,4). Затем лейкоциты центрифугированием в течение 10 мин при 1000 об/мин ресуспендировали в растворе Хенкса. После подсчета числа лейкоцитов концентрацию клеток доводили до 10⁶ л/мл. Суспензию клеток инкубировали с иммунокоррегирующими препаратами в течение 60 мин при 37°С. В контрольные кюветы вносили раствор Хэнкса. После инкубации производили запись кривых хемилюминесцентной реакции (ХЛ) с использованием хемилюминометра «Хелюм-111/01» (Россия) в комплексе с компьютером IBM-PC при температуре счетной камеры 37°С. В качестве усилителя свечения использовали люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион, «Sigma») в концентрации 10^-4 М, а в качестве активатора образования активных форм кислорода (АФК) РМА (форбол-12-миристат-13-ацетат, «Sigma») в концентрации 10^-6 М [3].

Затем вычисляли суммарную продукцию активных форм кислорода (АФК) как площадь под кривой ХЛ (фиг.1). Рассчитывали индекс стимуляции препарата (ИС) по формуле

ИС_{препарата}=S_{препарат}/S_{контроль},

где S_{препарат} – интенсивность ХЛ нейтрофилов в пробе с препаратом,

S_{контроль} – интенсивность ХЛ в контрольной пробе.

Препаратом выбора считали иммунокоррегирующий препарат, индекс стимуляции которого был больше 1,1.

Примеры реализации заявленного изобретения

В исследование включена группа, состоящая из 43 больных в возрасте от 18 до 52 лет, из них 34 лица мужского и 9 – женского пола, поступивших на плановое лечение по поводу рецидива папилломатоза гортани.

Всем больным произведено удаление папилломы гортани: у 31 при прямой микроларингоскопии под внутривенным наркозом с использованием инжекционной вентиляции легких, у 12 – при непрямой ларингоскопии под местной аппликационной анестезией 2% раствором дикаина.

Перед назначением терапии проводили анализ по оценке индивидуальной чувствительности к препаратам методом люминолзависимой хемолюминисценции.

На фиг.2 представлены кривые хемилюминесцентной реакции при анализе индивидуальной чувствительности к иммунокоректорам у больного В.

Иммунологическое исследование крови проводили до и после иммунотерапии. Комплекс лабораторных тестов включал стандартные унифицированные параметры (число лейкоцитов, лейкоцитарная формула), количество Т- и В-лимфоцитов, содержание натуральных киллеров, фагоцитарную активность нейтрофилов. Функциональная активность клеточного звена иммунитета оценивалась по количеству Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности рецептор к интерлейкину-2 и антигены HLA-DR.

В работе использовали следующие препараты:

– Полиоксидоний (N-оксидированное производное полиэтиленпиперозина с высоким молекулярным весом).

– Имунофан (синтетический гексапептид, представляет собой 32-36 аминокислотные остатки тимопоэтина).

– Циклоферон (низкомолекулярный индуктор интерферона – N-метилглюкаминовая соль карбоксиметилакридона).

Результаты.

При анализе иммунного статуса пациентов папилломой гортани до операции были выявлены следующие закономерности (табл.1): – снижение уровня Т-лимфоцитов, преимущественно за счет Т-хелперов (CD4); – повышение функциональной активности Т-клеточного звена иммунной системы; – сдвиг формулы влево; – снижение фагоцитарной активности нейтрофилов.

Впоследствии все пациенты были разделены на две группы в зависимости от результатов индивидуального подбора ИК: 1-ая группа – пациенты, получавшие ИК, который не являлся препаратом выбора в тесте индивидуального подбора (n=24); 2-ая группа – пациенты, получавшие ИК, который в тесте был определен как препарат выбора (n=19).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы обработки данных “Statistica 6.0.” (Statsoft, США, 2002). На первоначальном этапе статистической обработки, используя критерий Колмогорова-Смирнова, было доказано, что данные распределяются согласно закону нормального распределения. Это позволило применить t-критерий Стьюдента.

Был проведен анализ иммунологического статуса обеих групп, результаты которого представлены в таблице 2.

Как видно из представленных результатов, показатели в группе 1 и 2 достоверно не различались между собой до лечения. В течение 14 дней в группе 1 наблюдается повышение уровня Т-хелперов. Снизился уровень СД8- и СД20-лимфоцитов. За это же время в группе 2 отмечается достоверное увеличение уровня Т-лимфоцитов, преимущественно за счет Т-хелперов. Также отмечается достоверное повышение фагоцитарной активности нейтрофилов.

Таким образом исходя из поученных данных по сравнению с первой группой в группе 2 наблюдается достоверно более высокий уровень СД3, СД4 и СД8-лимфоцитов. Происходит нормализация фагоцитарной активности.

В литературе имеются данные, свидетельствующие о том, что функциональная активность нейтрофилов, выделяющих активную форму кислорода (АФК), напрямую зависит от количества СД4-лимфоцитов. Добавление anti-CD4-сыворотки в лейкоцитарную смесь приводит к резкому снижению уровня ХЛ (продукции АФК) нейтрофилами [10, 11]. По-видимому, этим можно объяснить, что ПК, подобранный методом ХЛ, оказывает максимальный стимулирующий эффект именно на субпопуляцию Т-хелперов (табл.2).

Таким образом, этот тест позволяет выбрать ИМ с оптимальным влиянием на клетки иммунной системы и исключить применение препаратов, вызывающих индивидуальные реакции подавления функциональной активности нейтрофилов.

Список литературы

1. Авдеев Г.И., Вядро М.М., Кадагидзе З.Г. Иммунотерапия опухолей. (Итоги науки и техники. Сер. Онкология. Т.14). – М., 1985.

4. Галактионов В.Г. Иммунология. Издательство Московского университета. 1998. – стр.350-353.

5. Гаращенко Т.И., Маркова Т.П., Ершов Ф.И., Ильенко Л.И., Современные достижения в лечении ювенильного папилломатоза гортани у детей. Новости оториноларингологии и логопедии. 1997. – №3. – с.62-63.

7. Клиническая иммунология и аллергология. / Под ред. Л.Йегера. – М., 1986. – Т.2. – С.425-458.

8. Иванченко Г.Ф., Прозоровская К.Н., Григорян С.С., Тарасенкова Н.Н. Исследование интерферонового статуса и применение препаратов интерферона и его индукторов у больных папилломатозом гортани. Вопросы практической фониатрии: (Материалы междунар. симпоз., 27-29 мая 1997 г.). М. 1997. С.83-87.

9. Кольцов В.Д., Онуфриева Е.К., Нурмухаметов Р.Х., Малиновская В.В. и др. Влияние антител к ₂– и -интерферонам на течение ювенильного респираторного папилломатоза у детей, получающих лечение препаратами ₂

14. Цветков Э.А., Савенко И.В. Структура иммунологического дефекта при папилломатозе у детей. Вестник оториноларингологии. 1996. – №4. – с.9-11.

15. Чекалина Т.Л. Клинико-иммунологическая оценка эффективности применения Фитомакс-40 в комплексном лечении больных лейкоплакией. Автореф. на соиск… к.м.н. Москва. – 2001. 21 с.

16. В.Антонiв, медичнi вicтi. VIII конгрес лiкарських товариств 16-20 серпня 2000 року, Львiв, с.100.

Формула изобретения

Способ индивидуального подбора иммунокоррегирующих препаратов при проведении иммунокоррегирующей терапии у больных папилломатозом гортани, отличающийся тем, что после проведенной операции по удалению папилломы гортани у больного производят забор периферической крови, получают лейкоцитарную суспензию, суспензию клеток инкубируют с иммунокоррегирующими препаратами в течение 60 мин при 37°С, затем производят запись кривых люминолзависимой хемилюминесцентной реакции (ХЛ) и рассчитывают индекс стимуляции препарата (ИС) по формуле

ИС_{препарата}=S_{препарат}/S_{контроль},

где S_{препарат} – интенсивность ХЛ в пробе с препаратом,

S_{контроль} – интенсивность ХЛ в контрольной пробе,

препаратом выбора считают иммунокоррегирующий препарат, индекс стимуляции которого больше 1,1.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 28.04.2008

Извещение опубликовано: 10.06.2010 БИ: 16/2010