Патент на изобретение №2320716
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ПЛОТНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для исследования микобактерий туберкулеза. Питательная среда содержит калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, L-аспарагин, глицерин, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, дистиллированную воду, пируват натрия, агар, гумивит и водный раствор желтка куриного яйца (1:1). Изобретение позволяет удешевить питательную среду и упростить бактериологические исследования. 4 табл.
(56) (продолжение): CLASS=”b560m”КОЗЛОВ Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии. – М.: МЕДГИЗ, 1950, с.199, 200.
Изобретение относится к микробиологическим исследованиям, касается питательной среды для культивирования микобактерий и может быть использовано для характеристики микобактерий по их биологической активности. Известны плотные питательные среды для выращивания первичных культур микобактерий, состоящие из яичной массы и солевой основы: Левенштейна-Йенсена, Гельберга, Петраньяни, среды Финн-2 и Мордовского /1/. Технология изготовления этих сред предусматривает их свертывание, что исключает возможность их использования в качестве компонента двухслойной среды для изучения биологической активности микобактерий. Цель изобретения – плотная питательная среда для культивирования микобактерий, пригодная для использования в качестве наслаиваемого компонента двухслойных сред. Поставленная цель достигается тем, что питательная среда, содержащая солевую основу и яичную основу, содержит в качестве солевой основы L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит и дистиллированную воду, а в качестве яичной основы – водный раствор желтка куриного яйца (1:1) при следующем соотношении компонентов:
Гумивит – щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО “Агропром”) представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот – гуминовых, гуматомелановых и фульвокислот /2/. Раствор солей гумусных кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов /3, 4/. Гумивит – жидкость темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста. Сущность способа поясняется примерами. Пример 1. Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 2,0 л наливали 300,0 мл дистиллированной воды, прогревали на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяли последовательно 2,0 г лимонной кислоты, 4,0 г L-аспарагина, 0,5 г сернокислого магния, 0,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,5 г пирувата натрия, 40,0 г глицерина, 90,0 мл гумивита и 30,0 г агара. Каждый компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов общий объем доводили до, 750,0 мл стерильной дистиллированной водой. Устанавливали рН 7,1-7,2 добавлением 1 н. NaOH или 1 н. HCl. Раствор автоклавировали в течение 30 минут при 1 атм. Свежие куриные яйца хорошо промывали в проточной воде, протирали 96° этиловым спиртом, разбивали в стерильных условиях и отделяли белок от желтка. В стерильной колбе смешивали желток и дистиллированную воду в соотношении 1:1 и 250,0 мл полученного раствора, добавляли в расплавленную агаровую среду, перемешивали, разливали по пробиркам по 3,0 мл и скашивали. Пример 2. В таблице 1 приведены варианты плотной питательной среды в соответствии с изобретением.
Пример 3. Для определения эффективности плотной питательной среды для культивирования микобактерий использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт.Vallee и BCG), M.tuberculosis (шт.Academia, H37Ra), M.avium (шт.ГИСК, 44, 659), M.smegmatis (шт.53), M.phlei. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур производили нанесением одной капли суспензии микобактерий, содержавшей 30-60 КОЕ при посеве на среду Левенштейна-Йенсена и на все сравниваемые варианты среды в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний, интенсивность роста (± слабый, + средний, ++ обильный) и изучали культурально-морфологические свойства. Контроль – плотная питательная среда Левенштейна-Йенсена. Полученные результаты (таблицы 2 и 3) показали, что оптимальными являются варианты 2 и 3 плотной питательной среды в соответствии с изобретением, обеспечивавшие более ранние сроки появления первичных колоний и более высокую интенсивность роста, относительно варианта 1 и сравнимые с таковыми на среде Левенштейна-Йенсена. Повышение количества гумивита (вариант 4 плотной питательной среды в соответствии с изобретением) не сокращало сроки появления роста и не повышало его интенсивность, поэтому было нецелесообразным. Культурально-морфологические свойства и цвет выросших колоний штаммов не отличались от таковых на исходной среде.
Пример 4. В таблице 4 приведены результаты исследования антагонистической активности пробиотика «Колибактерин» по отношению к микобактериям с использованием среды в соответствии с изобретением, которую наслаивали на засеянный пробиотическими штаммами мясопептонный агар.
Проведенные исследования подтвердили эффективность плотной питательной среды в соответствии с изобретением для культивирования микобактерий (сроки появления первичного роста и интенсивность роста сравнимы с таковыми на традиционно применяемых средах). Обратимость среды позволяет использовать ее в качестве наслаиваемого компонента двухслойной питательной среды при изучении биологических свойств микобактерий. Заявленная плотная питательная среда отличается дешевизной и технологичностью приготовления, а ее использование упрощает проведение бактериологических исследований благодаря визуализации начального роста колоний. Источники информации 1. Васильев В.Н. Микобактериозы и микозы легких. – София, 1971. – С.146-175. 3. Левинский Б.В. Все о гуматах. – Иркутск: ИП Марков С.Е., 1999. – 198 с. Формула изобретения
Плотная питательная среда для культивирования микобактерий, содержащая солевую и яичную основу, отличающаяся тем, что она содержит в качестве солевой основы L-аспарагин, калий фосфорно-кислый двузамещенный, серно-кислый магний, лимонную кислоту, лимонно-кислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит и дистиллированную воду, а в качестве яичной основы – водный раствор желтка куриного яйца (1:1) при следующем соотношении компонентов:
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 18.04.2008
Извещение опубликовано: 27.12.2009 БИ: 36/2009
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
