Патент на изобретение №2320715

(54) СПОСОБ ОТБОРА НЕФТЕОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ-ПРОДУЦЕНТОВ БИОСУРФАКТАНТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для отбора углеводородокисляющих бактерий-продуцентов поверхностно-активных веществ. Способ включает культивирование нефтеокисляющих бактерий на плотной среде в чашках Петри, при комнатной температуре. По окончании культивирования определяют морфотип колоний бактерий. Бактерии колоний М-типа отбирают как продуценты биосурфактантов. Бактерии колоний R- или S-типа смывают фосфатным буфером с рН 6,8, полученную суспензию разводят до оптической плотности 0,1-0,3 при длине волны 670 нм и определяют эмульгирующую активность и показатель гидрофобности клеток. При значении показателя гидрофобности более 20% и положительной эмульгирующей активности бактерии отбирают как продуценты биосурфактантов. Способ прост в осуществлении и позволяет отобрать нефтеокисляющие бактерии-продуценты внеклеточных и клеточно-связанных биосурфактантов. 1 ил., 4 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”бактериальных клеток по адсорбции на поверхности капель хлороформа, Микробиология, 2002, т.71, №2, с.237-239.

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для отбора углеводородокисляющих бактерий-продуцентов поверхностно-активных веществ, которые могут быть использованы для очистки загрязненных нефтью и нефтепродуктами почв, вод, нефтешламов.

Способы ликвидации нефтяных загрязнений, основанные на разложении нефтепродуктов микроорганизмами, признаны одними из наиболее безопасных и эффективных. Бактериальная деградация лимитируется гидрофобной природой углеводородов, их нерастворимостью в воде. Решение этой проблемы возможно в случае продукции углеводородокисляющими бактериями поверхностно-активных веществ – биосурфактантов (био-ПАВ). Они способны диспергировать нефтепродукты или гидрофобизировать поверхности клеток, что повышает эффективность контакта бактерий с углеводородами и облегчает биоразложение нефтепродуктов. Поиск микробов-продуцентов биоПАВ является актуальной задачей биотехнологии. Поскольку биосурфактанты являются химически разнородными соединениями, не имеющими общих хромофорных или реактивных групп, о способности бактерий их продуцировать в большинстве случаев судят по опосредованным признакам – снижению поверхностного натяжения, появлению эмульгирующей активности жидких культур. Для осуществления этих измерения необходимо получить жидкие культуры микроорганизмов, что трудоемко при исследовании большого количества штаммов. Поэтому для первичного скрининга потенциальных продуцентов среди больших выборок штаммов необходимо применение менее трудоемкого отбора культур, выращенных на плотных средах.

К недостатку способа относится возможность отбора только продуцентов экстрацеллюлярных биосурфактантов и отбор бактерий, продуцирующих гемолитические, но не поверхностно-активные вещества. Кроме того, кровяной агар является относительно дорогой питательной средой.

К недостаткам прототипа относится невозможность отбора бактерий-продуцентов клеточно-связанных биосурфактантов.

Технической задачей заявляемого технического решения является разработка простого, доступного способа отбора нефтеокисляющих бактерий-продуцентов внеклеточных и клеточно-связанных биосурфактантов.

Решение технической задачи достигается тем, что выращивают нефтеокисляющие бактерии на универсальной плотной питательной среде – питательном агаре. Среда стерильно разливается в чашки Петри, посев бактерий на ее поверхность осуществляют методом истощающего штриха. Засеянные чашки Петри инкубируют при комнатной температуре 20-25°С не менее 3 суток. По окончании культивирования визуально оценивают морфотип колоний каждого штамма – S, R или М-тип. Нефтеокисляющие бактерии, образующие на питательном агаре колонии М-типа, являются продуцентами биосурфактантов. Бактерии, образующие колонии S- или R-типа, смывают с поверхности питательного агара фосфатным буфером с рН 6,8. Полученную суспензию разводят до оптической плотности 0,1-0,3 условных единиц при длине волны 670 нм и определяют ее эмульгирующую активность и показатель гидрофобности клеток. Если суспензия бактерий, образующих на питательном агаре колонии S- или R-типа, обладает положительной эмульгирующей активностью и показателем гидрофобности клеток более 20%, то данные нефтеокисляющие бактерии являются продуцентами биосурфактантов.

где ПГ – показатель гидрофобности (%), ОП₀ – исходная оптическая плотность бактериальной суспензии (условные единицы), ОП₁ – оптическая плотность суспензии после встряхивания с хлороформом (условные единицы).

Оптимальную величину оптической плотности бактериальной суспензии для постановки теста Розенберга подбирали экспериментально. Для некоторых штаммов оптическая плотность суспензии после встряхивания (ОП₁) превышала оптическую плотность до встряхивания (ОП₀), возможно, вследствие образования оптически-плотной эмульсии “хлороформ в воде”, стабилизированной клетками. При ОП₁>ОП₀ формула (1) неприменима. Кроме того, при высокой концентрации клеток в суспензии их количество может превышать сорбционную емкость хлороформа, что приводит к искажению результатов теста Розенберга. Оптимальная для исследуемых штаммов концентрация клеток достигается при величине оптической плотности суспензии не более 0,3 условных единиц (Таблица 1). Нижний предел оптической плотности определяется диапазоном чувствительности применяемого для ее регистрации прибора, в нашем случае он составлял 0,1 условных единиц.

Использовали питательный агар производства ГНЦПМ г.Оболенск (Россия) следующего состава (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки – 24,0; натрий хлористый – 4,0; агар микробиологический – 12,0±2,0; рН 7,3±0,2.

Продолжительность культивирования составляла от 3 до 7 суток в зависимости от индивидуальной скорости роста каждого штамма.

На чертеже приведены сведения об эмульгирующей активности липидов, выделенных из клеток нефтеокисляющих бактерий.

Пример 1.

Исследованы 27 штаммов нефтеокисляющих бактерий коллекции кафедры генетики и микробиологии Кубанского государственного университета. Бактерии каждого штамма сеяли истощающим штрихом на поверхность плотного питательного агара указанного состава в чашках Петри, инкубировали при комнатной температуре в течение 3-7 суток, в зависимости от индивидуальной скорости роста. По окончании культивирования визуально оценили морфотип колоний: три штамма образовывали колонии М-формы, остальные 24 штамма образовывали колонии S- и R-форм. Биомассу бактерий, образовывавших колонии S- и R-форм, смывали с питательного агара фосфатным буфером, полученную суспензию клеток разводили до оптической плотности в пределах 0,1-0,3 условных единиц при длине волны 670 нм. Определяли эмульгирующую активность, показатель гидрофобности клеток по формуле (1). Положительный тест на эмульгирующую активность продемонстрировали 8 из 24 штаммов S, R-форм. Величина показателя гидрофобности их клеток составляла от 21 до 88% (Таблица 2).

В качестве потенциальных продуцентов биосурфактантов были отобраны: изоляты №2, 3, 4 – как образующие колонии М-типа; изоляты №18, 21, 22, 23, 24, 32, 34, 39 – как обладающие положительной эмульгирующей активностью и показателем гидрофобности >20%.

Пример 2.

где ЭА – эмульгирующая активность (%), Н_э – высота столбика эмульсии (мм), H – высота всего столбика жидкости в пробирке (мм).

Исходно поверхностно-активные свойства среды, инокулированной бактериями, отсутствовали: поверхностное натяжение – 64 мН/м, индекс эмульгации – 0%. В процессе роста бактерий произошло снижение поверхностного натяжения и появление эмульгирующей активности (Таблица 3), что свидетельствует о том, что отобранные бактерии продуцируют биосурфактанты.

С целью определения типа биосурфактантов – внеклеточные или клеточно-связанные, клетки отделили центрифугированием, измерили поверхностное натяжение и эмульгирующую активность полученных супернатантов. Как видно из таблицы 4, супернатанты культур четырех штаммов обладали эмульгирующей активностью, что свидетельствует о продукции внеклеточных биосурфактантов. Поверхностно-активные свойства пяти других штаммов были связаны с биомассой клеток, что свидетельствует о продукции ими клеточно-связанных биосурфактантов.

На основе представленных результатов можно заключить, что предлагаемый способ отбора нефтеокисляющих бактерий-продуцентов биосурфактантов обладает новизной, изобретательским уровнем, экспрессностью, не требует приготовления специальных или дорогих питательных сред, позволяет отбирать бактерии, продуцирующие как внеклеточные, так и клеточно-связанные биосурфактанты.

Формула изобретения

Способ отбора нефтеокисляющих бактерий-продуцентов биосурфактантов, включающий культивирование нефтеокисляющих бактерий на плотной среде в чашках Петри, при комнатной температуре, отличающийся тем, что по окончании культивирования определяют морфотип колоний бактерий, при этом бактерии колоний М-типа отбирают как продуценты биосурфактантов, бактерии колоний R- или S-типа смывают фосфатным буфером с рН 6,8, полученную суспензию разводят до оптической плотности 0,1-0,3 при длине волны 670 нм и определяют эмульгирующую активность и показатель гидрофобности клеток, при значении которого более 20% и положительной эмульгирующей активности бактерии отбирают как продуценты биосурфактантов.

РИСУНКИ