Патент на изобретение №2320714

(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА HAEMOPHILUS

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в медицине, в микробиологии в процессе приготовления питательной среды по отношению к бактериям рода Haemophilus. Питательная среда содержит аминопептид, гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, экстракт семян льна, глюкозу, карбонат натрия, НАД, гемин, хлорид натрия, агар и дистиллированную воду. Изобретение позволяет увеличить жизнеспособность клеток и уменьшить полиморфизм клеток в мазках. 1 табл.

(56) (продолжение):

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается увеличения ростовых свойств питательной среды по отношению к бактериям рода Haemophilus – в частности Н.influenzae типа b – одного из трех основных возбудителей гнойного бактериального менингита, а также в отношении бескапсульного штамма Н.influenzae №8143 и штамма другого вида – Н.parainfluenzae.

Изобретение может быть использовано в медицине, в микробиологии, в микробиологической промышленности в процессе приготовления питательных сред.

Изобретение заключается в том, что в известной питательной среде, содержащей источник азотного питания (ферментативный гидролизат крови животных – аминопептид), гидролизат казеина средней степени расщепления, экстракт кормовых дрожжей (источник витаминов), НАД, гемин, соль, в качестве источника факторов роста используют экстракт семян льна.

Прототипом служит питательная среда для получения рестриктирующих эндонуклеаз из бактерий рода Haemophilus. При выращивании на агаровых вариантах этих питательных сред Н.influenzae и Н.parainfluenzae образуют мелкие колонии (около 0,5 мм в диаметре) и в мазках из этих колоний, окрашенных по Граму, отмечены типичные мелкие грамотрицательные палочки, очень полиморфные, часто встречаются нитевидные формы и кроме того остатки разрушенных клеток.

Цель изобретения: разработка рецептуры питательной среды, обеспечивающей увеличение жизнеспособности клеток Н.influenzae b, бескапсульного штамма Н.influenzae и Н.parainfluenzae, определяемой по KOE, и диаметра выросших колоний, а также уменьшения полиморфизма клеток в мазках, что облегчает (способствует использованию) использование питательной среды в лабораторной практике.

Цель достигается тем, что в качестве препарата, дополнительно стимулирующего рост гемофильных бактерий, используется растительный экстракт, приготавливаемый из семян льна и добавляемый к ранее запатентованной среде в количестве 0,21-0,27 мас.%. Предлагаемая среда лишена этих недостатков, т.е. Н.influenzae b образуют колонии диаметром около 1 мм (почти в 2 раза крупнее – на 180% при р=0,05) и KOE – 200% по сравнению с прототипом (при р=0,05); в мазках – более однородные грамотрицательные палочки. Такие же результаты получены в отношении бескапсульного штамма Н.influenzae и Н.parainfluenzae.

Питательную среду готовят следующим образом.

К ингредиентам предложенной ранее питательной среды, в заданном соотношении, включая глюкозу и агар, добавляют водный экстракт семян льна, который получают после добавления к семенам льна кипящей дистиллированной воды (1:20), 3 часов экстракции в процессе остывания, осветления через марлевый фильтр. Для хранения экстракт семян льна стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. В питательную среду после стерилизации также при 121°С в течение 15 мин и остывания до 45-50°С добавляют необходимые для гемофилов факторы роста – НАД и гемин (10 мкг/мл) и готовую питательную среду разливают в чашки Петри.

Выращивание Н.influenzae и Н.parainfluenzae, проводят при 37°С в течение 18-24 часов.

Процент жизнеспособных клеток определяют по КОЕ (высев из разведения 10^-6 исходной взвеси густотой 10 ед.), диаметр колоний – путем их измерения с использованием специальной сетки с ценой деления 0,01 мм, морфологию клеток – в мазках из колоний, окрашенных по Граму.

Пример 1 (оптимальный). Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Пример 2 (минимальный). Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Пример 3 (максимальный). Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Данные по КОЕ, диаметру колоний и морфологии клеток изученных штаммов на предлагаемой и известной среде приведены в табл.1.

Качественные характеристики используемых экстрактов и гидролизата

– Кислотный гидролизат казеина средней степени расщепления

Аминный азот – (0,34-0,40)%

Общий азот – (0,55-0,65)%

Степень расщепления белка – 0,57-0,67

Содержание хлоридов – (1,6-1,8)%

рН 4,5-4,7

– Дрожжевой экстракт

Возможно использование экстракта кормовых дрожжей (ЭКД) или импортного дрожжевого экстракта (ДЭ)

ЭКД – аминный азот – (1,9-2,3)%; рН 5,2-6,2

ДЭ – аминный азот – (2,0-3,0)%; рН 6,5-7,0

– Экстракт семян льна

20 г лекарственной формы «льна семена» заливают 400 мл кипящей дистиллированной воды (1:20), настаивают 2 ч, фильтруют;

сухой остаток – (0,5-0,7)%; рН 5,7-6,1.

Кроме приведенной области применения предложенная питательная среда может служить основой в следующих случаях:

– при дифференциации бактерий рода Haemophilus в случае исключения из состава среды фактора роста – гемина выросшие колонии не будут относиться к виду Н.influenzae; при исключении и НАД, и гемина выросшие колонии не относятся к бактериям рода Haemophilus, нуждающимся в одном из перечисленных факторов роста;

– при добавлении соответствующих ингибирующих добавок среда может служить основой для селективной питательной среды для выделения бактерий рода Haemophilus – путем добавления бацитрацина (100 мкг/мл).

Формула изобретения

Питательная среда для выращивания бактерий рода Haemophilus, содержащая источники азотного питания, витаминов, НАД, гемин, хлорид натрия, карбонат натрия, глюкозу, агар и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она содержит в качестве стимулятора роста экстракт семян льна при следующем соотношении компонентов, мас.%: