Патент на изобретение №2320364

(54) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, конкретно к способам лечения злокачественных новообразований, способных к метастазированию. Способ лечения злокачественных новообразований включает введение лекарственного препарата, в качестве которого используется пептид формулы -D-Glu-D-Trp. Перед введением препарата проводят локальное облучение опухоли. 15 табл.

(56) (продолжение):

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, конкретно к способам лечения злокачественных новообразований, способных к метастазированию.

В последние десятилетия достигнуты значительные успехи в понимании механизмов метастазирования, однако, в области практического предотвращения этого процесса успехи весьма незначительны.

Одной из основных причин летальных исходов при лечении онкологических больных по-прежнему являются устойчивые к терапевтическому воздействию метастазы. Лечение метастазов может быть успешным только при тотальной деструкции опухолевых клеток. Но в процессе терапии рака могут сохраниться некоторые субпопуляции опухолевых клеток, имеющие большую по сравнению с исходной опухолью способность к метастазированию и повышенную устойчивость к используемому лечению. Такими клетками могут быть стволовые клетки опухоли, наличие которых продемонстрировано для лейкемии (Lapidot Т., Pflumio F., Doedens M., at all. Science. 1992. v.255. 1137-1141) и ряда солидных опухолей, например мозга и молочной железы (Singh SK, Hawkins С, Clarke ID at all. Nature 2004, v.432, p.396-401; Dontu G, Al-Hajj M, Abdallah WM, at all. Cell Prolif 2003, v.36, Suppl 1, p.59-72).

Известен способ лечения злокачественных новообразований кожной и подкожной локализации, при котором перед использованием химиотерапии вводят дозу никотиновой кислоты (Патент №2257899, A61К 38/08). Недостатком способа является рекрутирование депонированных объемов крови, что приводит к интенсификации процессов миграции, и, как следствие, может спровоцировать усиление гематогенного метастазирования.

Известен способ лечения рака предстательной железы, включающий введение химиопрепаратов и лучевую терапию, при котором в день начала лучевой терапии вводят цисплатину (Патент №2257894, А61К 38/08).

Известен способ лечения рака шейки матки, наиболее близкий к заявляемому способу, включающий наружное облучение и использование химиопрепаратов, соединенных с аутоплазмой, при котором с 1 по 4 день проводят наружное облучение, затем на 5 день вводят цисплатину с 250 мл физиологического раствора, а в последний день лечения вводят аутоплазму, инкубированную с цисплатиной. (Патент РФ №2261706, А61К 38/08).

Существенным недостатком обоих способов является отсутствие протекции в отношении начальных отделов гемопоэза, так как препаратами платины поражаются все три ростка кроветворения.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного способа лечения злокачественных новообразований – подавление процесса метастазирования солидных опухолей.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе лечения злокачественных новообразований, включающем введение лекарственного препарата, в качестве лекарственного препарата используют пептид формулы -D-Glu-D-Trp, перед введением которого проводят локальное облучение опухоли или химиотерапию.

Сущность способа заключается в том, что при лечении новообразований используют в качестве лекарственного препарата синтетический пептид формулы -D-Glu-D-Trp, перед введением которого проводят локальное облучение опухоли или химиотерапию с использованием препарата платины – платинола. Синтетический пептид формулы -D-Glu-D-Trp обладает иммунорегулирующим свойством, не токсичен (Патент №2107692, 6 С07К 5/065, А61К 38/08). Эксперименты проводят на самках мышей линии С57В16 весом 20 г. В качестве моделей используют Карциному Льюис, метастазирующую в легкие; спонтанно развившуюся, перевиваемую и метастазирующую в легкие опухоль молочной железы; лейкоз Раушера (эритробластный лейкоз) и тимому EL-4. Опухолевые клетки перевивают мышам под кожу бедра. При этом вначале образуется первичный опухолевый узел, а затем возникают вторичные (спонтанные) опухолевые узлы в легких.

Технический результат заявленного способа заключается в статистически достоверном снижении количества метастазов, как при сочетании пептида с локальным облучением, так и при сочетании с химиотерапией (платинолом). Так, последовательное воздействие платинолом и пептидом формулы -D-Glu-D-Trp снижает количество метастазов в легкие почти в 4 раза по сравнению с контролем.

Примеры выполнения изобретения приводятся ниже.

Пример 1. (Влияние пептида -D-Glu-D-Trp в комплексе с радио- и химиотерапией на спонтанное метастазирование и рост Карциномы Льюис).

Спонтанные метастазы Карциномы Льюис (КЛ) в легкие развиваются после перевивки опухолевых клеток мышам-реципиентам под кожу бедра. При этом вначале образуется первичный опухолевый узел, а затем возникают вторичные (спонтанные) опухолевые узлы в легких. В такой модели метастазирования оценивается действие исследуемых препаратов на ключевые этапы взаимодействия опухоль-организм. Исследовано влияния пептида формулы -D-Glu-D-Trp в комплексе с радиотерапией или цитостатиком (платинолом) на спонтанное метастазирование КЛ.

Эксперименты по изучению влияния пептида -D-Glu-D-Trp в комплексе с радиотерапией на спонтанное метастазирование КЛ проведены с использованием двух схем терапии на самках мышей линии С57В16 весом 20 г.

Схема 1 – Опухолевые клетки прививают подкожно, на заднюю правую лапу мышей в количестве 2,0·10⁶ кл/мышь. На 7-ые сутки роста опухоли (при среднем ее объеме 100-500 мм³) опухоль подвергают локальному облучению дважды, с интервалом 24 час в дозе 20 Гр. Пептид начинают вводить сразу после первого облучения (12,5 мкг/мышь), внутрибрюшинно (в/б), 1 раз в сутки и продолжают в течение 12 дней.

Схема 2 – Опухолевые клетки прививают подкожно, на заднюю правую лапу мышей в количестве 1,0·10⁶ кл/мышь. На 12-14-ые сутки роста опухоли (при среднем ее объеме 700-1000 мм³) опухоль подвергают локальному облучению дважды, с интервалом 24 час в дозе 20 Гр. Препарат начинают вводить сразу после первого облучения (12,5 мкг/мышь), внутрибрюшинно, 1 раз в сутки и продолжают в течение 12 дней.

Проведено по 4 независимых эксперимента на обеих выбранных экспериментальных моделях, в каждом из которых сформированы 4 группы: 1 – контрольная – мыши с опухолью без какого-либо воздействия; 2 – Пептид -D-Glu-D-Trp – мыши с опухолью, получающие -D-Glu-D-Trp по одной из описанных схем; 3 – Облучение – мыши с облученной локально опухолью, не получающие дополнительного лечения; 4 – Облучение + пептид -D-Glu-D-Trp – мыши с облученной локально опухолью, получающие препарат, как в группе 2. Группа в каждом из экспериментов содержит 7-8 мышей.

При исследовании влияния пептида -D-Glu-D-Trp в комплексе с препаратом платины (платинолом) на спонтанное метастазирование КЛ мышам-опухоленосителям (линия С57В16, самки, вес – 20 г) инъецируют платинол 5 мг/кг, в/б, 1 раз на 6-ые сутки роста опухоли (при среднем ее объеме 250 мм³). Пептид -D-Glu-D-Trp начинают вводить через сутки после цитостатика, 12,5 мкг/мышь, в/б, 1 раз в сутки, в течение 12 дней. Проведено по 4 независимых эксперимента, в каждом из которых сформированы 4 группы: 1 – контрольная – мыши с опухолью без какого-либо воздействия; 2 – Пептид -D-Glu-D-Trp – мыши с опухолью, получающие препарат по вышеописанной схеме; 3 – Платинол – мыши с опухолью, получающие платинол, как описано выше; 4 – Платинол + пептид – мыши с опухолью, получающие платинол, как в группе 3, и пептид, как в группе 2. Группа в каждом из экспериментов содержит 7-8 мышей.

На 21-е сутки роста опухоли (облучение по схеме 1, применение платинола) или на 28-е сутки роста (облучение по схеме 2) у экспериментальных мышей определяют число метастазов в легкие. Для этого извлеченные из животных-опухоленосителей легкие помещают на сутки в раствор Буэна и затем подсчитывают количество метастазов на поверхности легких.

Данные, представленные в таблицах 1 и 2, свидетельствуют, что применение пептида -D-Glu-D-Trp вызывает статистически значимое снижение количества метастазов как у необлученных мышей-опухоленосителей, так и при сочетанием применении пептида с локальным облучением при обеих схемах лечения. В комплексе с цитостатиком (платинол) пептид -D-Glu-D-Trp снижает количество спонтанных метастазов в легкие почти в 4 раза по сравнению с контролем (таблица 3).

Таблица 1.
Влияние пептида -D-Glu-D-Trp в сочетании с локальным облучением на образование спонтанных метастазов КЛ в легких (лечение по схеме 1).
Пептид -D-Glu-D-Trp	Облучение		Число мышей		Среднее кол-во метастазов
–	–		29		18,3±1,3*
+	–		30		9,0±1,3*
–	+		28		14,4±2,2**
+	+		29		7,7±1,2**
*, ** – р<0,05
Таблица 2.
Влияние пептида -D-Glu-D-Trp в сочетании с локальным облучением на образование спонтанных метастазов КЛ в легких (лечение по схеме 2).
Пептид -D-Glu-Trp		Облучение	Число мышей	Среднее кол-во метастазов
–		–	24	41,4±3,3*
+		–	30	24,2±3,6*
–		+	25	23,1±2,2**
+		+	30	12,2±1,5**
*, ** – р<0,05

Таблица 3.
Влияние пептида -D-Glu-Trp в сочетании с платинолом на образование спонтанных метастазов КЛ в легких.
Пептид -D-Glu-rp	Платинол	Число мышей	Среднее кол-во метастазов
–	–	28	24,8±2,3
+	–	30	12,9±1,2*
–	+	27	13,4±1,5*
+	+	30	7,0±2,1*#
* – р<0,05 по отношению к контролю; # – р<0,05 по отношению ко 2-ой и 3-ей группам

Кроме метастазирования, во всех экспериментах проводят изучение эффективности примененных схем терапии на рост солидной опухоли КЛ. Комбинированное воздействие локального облучения (схема 1 и схема 2) или цитостатика и пептида -d-Glu-Trp оценивают по индексу роста (ИР), который определяют как отношение объема опухоли в день очередного измерения (V) к объему опухоли в нулевой день (V₀) (первое облучение или введение цитостатика) – ИР=V/V₀. Объем опухоли рассчитывают по трем величинам: глубина/2 × ширина × длина (мм³), которые измеряли на 2, 5, 7, 9 и 12 день после первого облучения.

Усредненные результаты четырех независимых экспериментов (лечение по схеме 1), представленные в таблице 4, свидетельствуют, что применение пептида -D-Glu-Trp приводит к определенному замедлению роста опухоли у необлученных мышей (во все сроки измерения, кроме 2 суток, значения ИР статистически достоверно отличаются от контроля). Время удвоения (Т1/2) опухоли в контрольной и опытной группах близки по своим значениям (Таблица 5).

При совместном применении локального облучения и пептида -D-Glu-D-Trp также наблюдается определенное снижение значений ИР по сравнению с группой Облучение (значения ИР статистически достоверно отличаются от только облучения на 5-е, 9-е и 12-е сутки после начала лечения) (Таблица 4). В результате совместного применения облучения и пептида значение времени удвоения опухоли в 1,5 раза превышает таковое только для облучения. Следует также отметить сниженное значение коэффициента корреляции (r=0,6) в группе Облучение + пептид -D-Glu-D-Trp по сравнению только с Облучением. Такая корреляция между ИР и временем роста опухоли может свидетельствовать о более выраженном замедлении роста опухоли при комплексном применении пептида и облучения по сравнению с группой Облучение (Таблица 5).

Таблица 4.
Значения индекса роста (ИР) Карциномы Льюис в условиях сочетанного применения пептида -D-Glu-D-Trp и локального облучения (лечение по схеме 1).
Группа	Значения ИР
	0 сутки	2 сутки	5 сутки		7 сутки	9 сутки		12 сутки
Контроль	1	2,6±0,3	4,9±0,5*		11,3±0,7*	14,8±1,0*		–
Пептид -D-Glu-D-Trp	1	2,2±0,1	3,8±0,3*		8,9±0,6*	11,1±0,8*		–
Облучение	1	1,5±0,06	1,6±0,1**		1,8±0,1	2,7±0,2**		6,0±0,6
Облучение + пептид -D-Glu-D-Trp	1	1,6±0,07	1,2±0,1**		1,6±0,1	2,1±0,1**		2,9±0,3**
**, *-р<0,05
Таблица 5.
Значения времени удвоения Карциномы Льюис (Т1/2) и коэффициента корреляции (r) (ИР – время роста) в условиях сочетанного применения пептида -D-Glu-D-Trp и локального облучения (лечение по схеме 1).
Группа				Т1/2 (сутки)			r±m
Контроль				2,46			0,94±0,15
Пептид -D-Glu-D-Trp				2,95			0,84±0,22
Облучение				6,14			0,81±0,14
Облучение + пептид -D-Glu-D-Trp				10,6			0,61±0,15

Усредненные результаты следующих четырех независимых экспериментов (лечение по схеме 2, начиная с 12-х суток роста) представлены в таблице 6. В данных условиях пептид -D-Glu-D-Trp, хотя и слабо, ингибирует рост опухоли у необлученных животных, (во все сроки измерения, кроме 2-х суток, значения ИР в экспериментальных группах статистически достоверно отличаются от контроля). Однако значение Т1/2 опухоли в опытной группе практически равно таковому в контроле (Таблица 7).

При совместном применении локального облучения и пептида -D-Glu-D-Trp происходит статистически достоверное снижение значений ИР по сравнению с группой Облучения, начиная с 5-х суток после начала лечения (Таблица 6). Время удвоения опухоли в данном случае в 4 раза превышает таковое для группы Облучение. Слабая корреляция между ИР и временем роста опухоли при комбинированной терапии (r=0,18) также свидетельствует о практически полном торможении опухолевого процесса с 5-х по 12-е сутки лечения (Таблица 7).

Таблица 6.
Значения индекса роста (ИР) Карциномы Льюис в условиях сочетанного применения пептида -D-Glu-D-Trp и локального облучения (лечение по схеме 2).
Группа	Значения ИР
	0 сутки	2 сутки	5 сутки		7 сутки	9 сутки		12 сутки
Контроль	1	1,8±0,1	3,0±0,2*		4,4±0,2*	5,9±0,2*		–
Пептид -D-Glu-D-Trp	1	1,4±0,07	2,0±0,2*		3,3±0,3*	4,8±0,3*
Облучение	1	1,1±0,07	1,3±0,2**		1,8±0,4**	2,7±0,3**		3,6±0,3**
Облучение + пептид -D-Glu-D-Trp	1	1,0±0,05	0,8±0,04**		0,9±0,1**	1,5±0,3**		2,0±0,3**
* р<0,05, ** – р<0,01
Таблица 7.
Значения времени удвоения Карциномы Льюис (Т1/2) и коэффициента корреляции (r) (ИР – время роста) в условиях сочетанного применения пептида -D-Glu-D-Trp и локального облучения (лечение по схеме 2).
Группа				Т1/2 (сутки)			r±m
Контроль				4,21			0,95±0,17
Пептид -D-Glu-D-Trp				3,95			0,93±0,09
Облучение				8,2			0,72±0,15
Облучение + пептида -D-Glu-D-Trp				35,25			0,18±0,18

Таким образом, при начале лечения КЛ на 12-е сутки роста (схема 2) пептид -D-Glu-D-Trp слабо подавляет рост опухоли у необлученных мышей, однако при комплексном применении с локальным облучением тормозит опухолевой процесс в гораздо большей степени, чем только локальное облучение опухоли.

Проведено также исследование влияния пептида -D-Glu-D-Trp на рост Карциномы Льюис при применении в комплексе с препаратом платины (платинолом). На 6-е сутки роста опухоли (при среднем ее объеме 250 мм³) мышам-опухоленосителям инъецируют Платинол 5 мг/кг, в/б, 1 раз. Пептид -D-Glu-D-Trp начинают вводить через сутки после цитостатика, 12,5 мкг/мышь, в/б, 1 раз в сутки, в течение 10 дней. За день 0 принимают день введения платинола. Измерение параметров опухоли проводят на 2, 5, 7 и 9 день после инъекции цитостатика.

Результаты, представленные в таблице 8, демонстрируют, что совместное применение пептида -D-Glu-D-Trp и платинола оказывает эффект, аналогичный только цитостатику, т.е. пептид не ослабляет противоопухолевое действие платинола.

Таблица 8.
Значения индекса роста (ИР) Карциномы Льюис в условиях сочетанного применения пептида -D-Glu-D-Trp и цитостатика (платинола).
Группа	Значения ИР
	0 сутки	2 сутки	5 сутки	7 сутки	9 сутки	12 сутки
Контроль	1	3,9±0,4	8,5±0,3*	13,5±0,4*	20,4±1,2*	–
Пептид -D-Glu-D-Trp	1	3,3±0,2	6,6±0,4*	10,6±0,7*	15,4±0,8*	–
Платинол	1	2,1±0,1	4,3±0,3	7,7±0,7	12,6±1,0	20,5±1,5
Платинол + пептид -D-Glu-D-Trp	1	2,0±0,09	4,2±0,2	7,5±0,5	11,0±1,5	18,9±1,4
* – р<0,05

Таким образом, обнаружено, что пептид -D-Glu-D-Trp способен усиливать антиметастатическое и даже, в определенной мере, противоопухолевое действие облучения и цитостатиков.

Пример 2. (Влияние пептида -D-Glu-D-Trp в комплексе с радиотерапией на метастазирование и рост спонтанной метастазирующей опухоли молочной железы).

В качестве второй модели используют мышиную спонтанно развившуюся, перевиваемую и метастазирующую в легкие опухоль молочной железы у мышей линии СВА, гистологически идентифицированную как солидный трабекулярный рак.

Клетки, взятые из спонтанно развившейся опухоли молочной железы, перевивают на бедро мышей СВА. Опухоль интенсивно растет при такой перевивке и метастазирует в легкие. Таким образом проведено 9 пассажей. При 10-ом пассаже опухолевые клетки (2,0-10 кл/мышь) перевивают подкожно, на заднюю правую лапу экспериментальных мышей. На 7-е сутки роста опухоли (при среднем ее объеме 300-350 мм³) опухоль подвергают локальному облучению в дозе 30 Гр. Пептид -D-Glu-D-Trp начинают вводить сразу после первого облучения (12,5 мкг/мышь), внутрибрюшинно, 1 раз в сутки и продолжают в течение 12 дней.

На 20-е сутки роста опухоли у экспериментальных мышей определяют число метастазов в легкие. Для этого извлеченные у животных-опухоленосителей легкие помещают на сутки в раствор Буэна и затем подсчитывают количество метастазов на поверхности легких.

Эффекты комбинированного воздействия локального облучения и пептида -D-Glu-D-Trp на рост опухоли оценивают по индексу роста (ИР), который определяют как отношение объема опухоли в день очередного измерения (V) к объему опухоли в нулевой день (V₀) (первое облучение) – ИР=V/V₀. Объем опухоли рассчитывают по трем величинам: глубина/2 × ширина × длина (мм³), которые измеряют на 3, 6, 8, 10 и 12 день после облучения.

Проведено 2 независимых эксперимента, в каждом из которых были сформированы 4 группы: 1 – контрольная – мыши с опухолью без какого-либо воздействия; 2 – Пептид -D-Glu-D-Trp – мыши с опухолью, получающие пептид по вышеописанной схеме; 3 – Облучение – мыши с облученной локально опухолью, не получающие дополнительного лечения; 4 – Облучение + пептид -D-Glu-D-Trp – мыши с облученной локально опухолью, получающие пептид, как в группе 2. Группа в каждом из экспериментов содержит 9-10 мышей.

У экспериментальных мышей на 20-е сутки роста подсчитывают метастазы в легкие. Как видно из усредненных данных, представленных в таблице 9, применение пептида -D-Glu-D-Trp вызывает статистически значимое снижение в 2 раза количества метастазов у мышей-опухоленосителей при сочетанием применении пептида с локальным облучением. При этом в группе Облучение + пептид -D-Glu-D-Trp у 47% мышей-опухоленосителей отсутствуют метастазы в легких, в то время как в группе Облучение этот параметр составляет 7%.

Таблица 9.
Влияние -D-Glu-D-Trp в сочетании с локальным облучением спонтанной опухоли молочной железы на образование спонтанных метастазов в легких.
Пептид -D-Glu-D-Trp	Облучение	Кол-во мышей	Среднее кол-во метастазов	% мышей без метастазов
–	–	18	4,6±0,75	0
+	–	20	3,4±0,4	15
–	+	19	4,7±0,9*	7
+	+	19	2,3±0,7*	47
* – р=0,004

Исследование влияния пептида -D-Glu-D-Trp на рост опухоли выявило (таблица 10), что препарат не меняет динамику роста опухолевого узла у необлученных мышей (во все сроки измерения значения ИР статистически достоверно не отличаются от контроля). При совместном применении локального облучения и пептида -D-Glu-D-Trp с 3-х суток после начала лечения наблюдается статистически значимое снижение значений ИР по сравнению с группой Облучение. Следует отметить, что в группе Облучение + пептид -D-Glu-D-Trp на 8-е сутки после облучения у 70%, а на 10-е – у 30% мышей опухоль отсутствует, в то время как в группе только облученных животных опухоль отсутствует на 8-е сутки только у 10% животных, а на 10-е – обнаруживается у всех мышей-опухоленосителей.

Таблица 10.
Значения индекса роста (ИР) спонтанной опухоли молочной железы в условиях сочетанного применения пептида -D-Glu-D-Trp и облучения.
Группа	Значения ИР
	0 сутки	3 сутки	6 сутки	8 сутки	10 сутки	12 сутки
Контроль	1	3,8±0,2	6,7±0,5	10,9±0,9	14,5±1,2	–
Пептид -D-Glu-D-Trp	1	4,0±0,3	6,7±0,4	10,8±0,8	14,2±0,9	–
Облучение	1	2,2±0,1*	1,5±0,2*	2,4±0,5*	4,8±1,5*	5,7±1,8
Облучение + пептид -D-Glu-D-Trp	1	1,8±0,07*	0,5±0,08*	0,7±0,1*	0,7±0,4*	1,4±0,5
* – р<0,005

Таким образом, продемонстрировано, что только в сочетании с локальным облучением спонтанной опухоли молочной железы пептид -D-Glu-D-Trp снижает в 2 раза количество метастазов в легкие и существенно подавляет рост опухоли. Следует отметить, что коэффициент корреляции (интенсивность роста – время роста) в этом случае представляет отрицательную величину (-0,14±0,1), что свидетельствует о регрессии опухоли.

Пример 3. (Влияние пептида -D-Glu-D-Trp на искусственное метастазирование Карциномы Льюис).

При использовании модели искусственного метастазирования опухолевые клетки вводят мышам-реципиентам внутривенно и они попадают непосредственно в капилляры легких, быстро образуют опухолевые узлы без наличия первичной опухоли. Эта модель метастазирования удобна для оценки воздействия препаратов на сами циркулирующие опухолевые клетки и процессы их адгезии в капиллярах легких. При этом в значительной степени удается исключить влияние факторов сложного взаимодействия опухоль – организм хозяина.

Как нами было показано, пептид -D-Glu-D-Trp снижает в 2 раза число спонтанных метастазов Карциномы Льюис в легкие. В связи с полученными результатами проведено исследование влияния данного препарата на искусственное метастазирование Карциномы Льюис.

Для этого опухолевые клетки (2×10⁵) в 0,5 мл среды 199 вводят мышам внутривенно. На 16-е сутки у этих животных подсчитывают метастазы в легких. Обработку пептидом в случае (in vitro) опухолевые клетки перед инъекцией реципиентам инкубируют с препаратом (0,2 мкг/мл суспензии) 30 мин при 37°С. Во втором случае (in vivo) пептид -D-Glu-D-Trp вводят внутрибрюшинно (12,5 мкг/мышь), начиная с первого часа после введения опухолевых клеток, по одному разу в сутки в течение 4-х дней. В третьем случае (in vitro+in vivo) совмещают обе выше описанные обработки. Результаты экспериментов, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что пептид -D-Glu-D-Trp, примененный по трем испытанным схемам, снижает число метастазов в легкие в 2 раза.

Таблица 11.
Влияние пептида -D-Glu-D-Trp на искусственное метастазирование Карциномы Льюис в легкие.
Пептид -D-Glu-D-Trp in vitro	Пептид -D-Glu-D-Trp in vivo	Число мышей	Среднее число метастазов	Р
–	–	20	26,5±1,5*
+	–	20	12,4±1,2	<0,0001
–	+	20	16,7±1,6	0,00028
+	+	20	12,3±1,5	<0,0001
* – достоверность рассчитана по отношению к данной группе.

Проведено исследование интенсивности образования метастазов в легких при внутривенном введении клеток Карциномы Льюис на фоне предварительной обработки реципиентов различными дозами пептида -D-Glu-D-Trp. Препарат инъецируют интактным мышам-реципиентам в дозах от 10 мкг/кг до 25 мг/кг дважды – за 48 и 24 часа до введения опухолевых клеток. Кроме того, суспензию опухолевых клеток инкубируют с пептидом -D-Glu-D-Trp (0,2-20 мкг/мл) при 37°С в течение 30 мин, отмывают центрифугированием и вводят интактным реципиентам, а в одном случае – обработанным препаратом. Метастазы подсчитывают на 16-е сутки.

Результаты, представленные в таблице 12, свидетельствуют, что предобработка реципиента пептидом -D-Glu-D-Trp приводит к снижению числа метастазов Карциномы Льюис в легкие, причем эффект имеет обратную зависимость от дозы препарата. Кроме того, непосредственное воздействие на опухолевые клетки препарата (инкубация) снижает интенсивность искусственного метастазирования. Однако в этом случае отсутствует зависимость эффекта от дозы препарата. Комплексная обработка и реципиента и опухолевых клеток пептидом -D-Glu-D-Trp не приводит к суммированию эффекта.

Таблица 12.
Влияние пептида -D-Glu-D-Trp, примененного в спектре доз, на искусственное метастазирование Карциномы Льюис.
Обработка реципиента (пептид -D-Glu-D-Trp мкг/кг/на инъекцию)	Обработка клеток КЛ пептидом -D-Glu-Trp мкг/мл	Среднее кол-во метастазов	Р
–	–	15,3±1,1*
10,0	–	5,3±0,9	<0,001
100,0	–	5,8±1,4	<0,001
1000,0	–	5,9±0,9	0,00001
5000,0	–	8,2±0,6	0,00002
25000	–	9,4±0,6	0,00015
–	0,02	6,1±1,1	0,00001
–	0,2	7,4±1,1	0,001
–	2,0	7,1±1,2	0,0001
1000	0,2	7,0±0,7	0,0001

Пример 4. (Влияние пептида -D-Glu-D-Trp на развитие лейкоза Раушера).

Исследование проведено на мышах линии BALB. Лейкоз Раушера (ЛР) (эритробластный лейкоз) развивается у мышей к 15-17 суткам после перевивки опухолевых клеток, источником которых служит селезенка больных животных. Заражение мышей проводят путем перевивки 10-12 млн кл/мышь, внутрибрюшинно. Развитие заболевания регистрируют по весу селезенок больных животных.

Исследуют влияние пептида -D-Glu-D-Trp на фазу инициации ЛР, а также используют его в качестве терапевтического средства при уже сформировавшемся лейкозе. Каждая экспериментальная группа содержит 10 мышей. В первом случае препарат начинают вводить через 24 часа после перевивки, инъецируют ежедневно, в течение 14 дней (10 мкг/кг, внутрибрюшинно). Контрольным животным в обоих случаях вводят физиологический раствор в те же сроки. На 17-е сутки у экспериментальных животных определяют вес селезенок. Из полученных результатов, представленных в таблице 1, можно сделать вывод, что пептид -D-Glu-D-Trp не интенсифицирует развитие ЛР (не оказывает влияния на фазу инициации лейкоза).

При использовании для лечения ЛР пептид -D-Glu-D-Trp начинают вводить с 15 суток после прививки лейкозных клеток. Инъекции проводят в течение 3 недель, ежедневно, пятидневными курсами с двухдневным перерывом между ними, 10 мкг/кг, внутрибрюшинно. На 40-й день после перевивки клеток у животных определяют вес селезенок. Полученные экспериментальные данные (таблица 13) свидетельствуют, что лечение пептидом -D-Glu-D-Trp приводит к статистически достоверному снижению веса селезенок больных мышей.

Таблица 13.
Влияние пептида -D-Glu-D-Trp на фазу инициации (17 сутки) и развитие (50 сутки) Лейкоза Раушера (по тесту веса селезенок)
Группа	Средний вес селезенки (мг) на
	17 сутки	40 сутки
Физиологический раствор	197,5±,0	374,0±7,0
Пептид -D-Glu-D-Trp	173,0±8,0	149,0±6,0*
Вес селезенок интактных мышей – 73,3±4,8 мг
* р<0,05 по отношению к контролю.

Таким образом, пептид -D-Glu-D-Trp обладает определенным лечебным и ингибирующим действием на развитие лейкоза Раушера при введении животным.

Пример 5. (Влияние пептида -D-Glu-D-Trp на рост тимомы EL-4)

Исследование проведено на мышах линии С57В1/6, самках. Клетки тимомы EL-4, (10⁶ клеток/0,1 мл) прививают мышам-реципиентам под кожу спины. Пептид -D-Glu-D-Trp (10 мкг/кг) вводят мышам-реципиентам внутрибрюшинно, начиная с 3-х суток после прививки опухоли, пятидневными курсамис двухдневными перерывами между ними в течение 3-х недель. Каждая экспериментальная группа содержит 14 мышей. За ростом опухоли EL-4 и выживаемостью мышей-опухоленосителей наблюдают 60 суток. Данные, приведенные в таблице 15, свидетельствуют, что в результате лечения пептидом -D-Glu-D-Trp наблюдается уменьшение размеров опухолевого узла до 16 сут роста, однако на выживаемость и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей-опухоленосителей препарат существенного влияния не оказывает.

Таблица 15.
Влияние -D-Glu-D-Тгр на рост тимомы EL-4
Группа	Размер опухоли мм2
	8 сутки	10 сутки	12 сутки	14 сутки	16 сутки
Контроль	30,8±6,2	90,4±11,2	255,5±30,5*	487,4±74,8*	543,4±91,5
Пептид -D-Glu-D-Trp	14,0±3,3	80,0±9,3	155,7±18,3*	228,3±51,2*	247,8±89,6
* – р<0,05

Таким образом, использование заявленного способа приводит к статистически достоверному снижению количества метастазов в легкие по сравнению с контролем в 2-4 раза. Так, введение пептида формулы -D-Glu-D-Trp в сочетании с платинолом приводит к снижению количества спонтанных метастазов в легкие почти в 4 раза.

Кроме того, пептид способен усиливать в определенной мере противоопухолевое действие облучения и цитостатиков и оказывать радиопротекторное действие на начальные этапы гемопоэза при отсутствии такового в отношении клеток опухоли.

Формула изобретения

Способ лечения злокачественных новообразований, включающий введение лекарственного препарата, отличающийся тем, что в качестве лекарственного препарата используют пептид формулы -D-Glu-D-Trp, причем перед введением пептида проводят локальное облучение новообразования.

PC4A – Регистрация договора об уступке патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Прежний патентообладатель:

Закрытое акционерное общество “ЦЕНТР “ПЕПТОС”,
ГУ Медицинский Радиологический Научный Центр РАМН

(73) Патентообладатель:

Общество с ограниченной ответственностью “ПЕПТОС ФАРМА”

(73) Патентообладатель:

ГУ Медицинский Радиологический Научный Центр РАМН

Договор № РД0048528 зарегистрирован 27.03.2009

Извещение опубликовано: 10.05.2009 БИ: 13/2009