Патент на изобретение №2320334

(54) СРЕДСТВО ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ РОСТА ОПУХОЛИ И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ РОСТА ОПУХОЛИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано в ветеринарной практике для профилактики злокачественных новообразований домашних животных и в медико-биологических исследованиях для разработки способов профилактики и лечения онкологических заболеваний. Изобретение заключается в том, что животным до перевивки лимфосаркомы Плисса per os ежедневно в дозе 90-100 мг/кг веса вводят препарат «олигохит актив» общим курсом не менее 7 дней. Изобретение позволяет расширить арсенал средств для ингибирования роста опухоли и увеличить продолжительность жизни животных посредством введения данного препарата. 2 н.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии, а именно к экспериментальной онкологии, и может использоваться в ветеринарной практике для профилактики злокачественных новообразований домашних животных и в медико-биологических исследованиях для разработки способов профилактики и лечения онкологических заболеваний.

Поиск новых подходов к профилактике злокачественных новообразований остается актуальной медико-биологическим задачей.

Большинство способов ингибирования роста опухолей включают введение химиопрепаратов [2, 4, 14, 17, 20, 22, 29].

Известен способ профилактики опухолевой болезни в эксперименте, для осуществления которого через 1 час после перевивки культуры опухолевых клеток экспериментальным животным у них из подключичной вены забирают 1 мл крови в герметично закрытый флакон с антикоагулянтом, добавляют туда циклофосфан, инкубируют смесь в течение 30 минут, реинфузируют крысам внутривенно, струйно, однократно [22].

Известен способ ингибирования роста опухоли в эксперименте с помощью цитостатика доксорубицина [17], который применяли в сверхмалых дозах на модели карциномы легких Льюиса у мышей BDG. Препарат вводили однократно внутрибрюшинно на следующие сутки после перевивки опухоли в дозах 10^-5, 10^-10, 10^-15 и 10^-20 М. Для сравнения использована стандартная терапевтическая доза доксорубицина 8 мг/кг массы тела животного, что соответствует 1,4×10^-3 М. Найдена способность доксорубицина в сверхмалых дозах вызывать противоопухолевый эффект при указанной постановке опыта, сопоставимый с эффектом, полученным при применении стандартной терапевтической дозы. На 12 сутки размер опухоли у экспериментальных животных, получавших стандартную и сверхмалую дозы химиопрепарата, был уменьшен в среднем на 80% по сравнению со значениями у контрольных, т.е. не получавших химиопрепаратов, животных.

Однако предложенные способы, наряду с высокой эффективностью ингибирования роста опухоли, вызывают опосредованные патологические изменения в других органах и системах организма, что является основным ограничением к их применению.

Недостатком ряда исследований, в которых экспериментальная оценка эффективности применения разработанных способов ингибирования опухоли проводится в условиях in vitro [2, 5, 7, 16, 29], является неполное представление о побочных эффектах действия используемых веществ на организм.

В большинстве способов ингибирования роста опухолей, эффективность применения которых показана в условиях in vivo, в эксперименте исследуемые вещества вводят после индукции или трансплантации опухоли [12, 14, 16, 20, 26].

Способов ингибирования роста опухоли при введении веществ до индукции или трансплантации опухоли не обнаружено.

Поэтому авторы полагают, что техническое решение является новым и соответствует критерию «изобретательный уровень».

В задачу предлагаемого изобретения положено расширение арсенала средств для ингибирования роста опухоли, а также разработка способа применения нового средства.

Поставленная задача достигается тем, что предлагается:

1. Применение комплекса «олигохит актив» в качестве средства для ингибирования роста опухоли.

2. Способ ингибирования роста опухоли в эксперименте, включающий введение лекарственного средства, отличающийся тем, что животным до перевивки опухоли per os ежедневно в дозе 90-100 мг/кг веса вводят препарат «олигохит актив» общим курсом не менее 7 дней.

«Олигохит актив» (иногда употребляют синоним – олигосахарид хитозана сукцинат-аскорбат) (ТУ 9289-004-57184729-03) представляет собой водорастворимый продукт, в котором олигосахарид хитозана (олигохит) (70%), сукцинат (15%) и аскорбат (15%) находятся в ионной связи друг с другом. В физиологических условиях янтарная кислота диссоциирована, поэтому название ее аниона – сукцинат, часто применяют как синоним термина «янтарная кислота», а аскорбат – как синоним термина «аскорбиновая кислота». Исследования последних лет показали наличие у сукцината биологической активности с уникальным сочетанием проявлений: по отношению к здоровому организму он выступает в роли адаптогена, а при наличии патологических проявлений демонстрирует нетипично высокий для адаптогенов терапевтический эффект [31]. Сукцинат является нормальным клеточным метаболитом, играет большую роль в обеспечении энергетического баланса в клетке [3, 10, 15], обладает антигипоксическим [13, 31, 32], антиоксидантным [8, 31], радиопротекторным [11] и детоксицирующим действиями [31]. Известны несколько работ, в которых сообщается о результатах применения янтарной кислоты (ЯК) при опухолевом росте: T.Kamata с сотр. (1970) наблюдали торможение роста саркомы М-1 у крыс после введения ЯК [15], А.Л.Коваленко и М.Г.Романцов (1999) показали, что в результате введения ЯК наблюдается существенное уменьшение частоты спонтанных опухолей мышей и увеличение максимальной продолжительности их жизни [8]; Е.В.Козырева (1997) выявила снижение показателя смертности онкологических больных на фоне комплексного применения янтарной, лимонной и о-кетоглутаровой кислот с витаминами и травами [9]. И.А.Помыткин и С.П.Соловьев предложили в комплексе с изотопологами использовать соль ЯК как дополнительное средство в лечении новообразований [19]. Однако в работе В.Н.Анисимова и М.Н.Кондрашовой показано, что подкожные введения животным сукцината натрия в дозе 50 и 250 мг/кг в течение 10 дней, начиная с 3-го дня после трансплантации опухолей, мало влияли на рост перевиваемых опухолей у мышей и крыс [1].

В настоящее время аскорбиновая кислота (АК) применяется в комплексной терапии злокачественных новообразований. Однако данные литературы о влиянии АК на рост опухолей противоречивы. Л.С.Трухановой (1987) на модели канцерогенеза, индуцированного 1,2-диметилгидразином и эстрадиолдипропионатом, показано, что при введении мышам линии СВА растворов АК в концентрациях 0,3; 0,75; и 1,5% наблюдается отчетливая тенденция к уменьшению массы опухоли с увеличением концентрации АК [24]. В работе М.Polydock et al. показано увеличение продолжительности жизни (в 2 раза) мышей с асцидной карциномой Эрлиха на фоне введения АК в дозе 10 мг/кг [33], а по наблюдениям Т.Shingu et al. – ускорение роста опухоли (доза 25 мг/сутки) [34]. В эксперименте И.А.Харьковской с сотр. введение морским свинкам АК в дозе 0,3 мг/кг массы приводило к полному рассасыванию саркомы, а в дозе 1 г/кг – ускорение роста опухоли [27]. Следовательно, вопрос о возможностях применения этого витамина в онкологии остается открытым.

В последние годы в различных областях медицины широко применяется хитозан и его производные. Хитозан получают путем переработки морских ракообразных, а после ферментативного расщепления высокомолекулярного хитозана образуется новый, водорастворимый продукт – олигосахарид хитозана (синоним – олигохит). В таком виде он легко абсорбируется в кишечнике и быстро попадает в системный кровоток, а затем с током крови доносится к «органам-мишеням». Одно из новых направлений использования его в качестве носителя для лекарственных форм [28]. К.А.Трескуновым и Б.А.Комаровым предложено применять хитозан в виде солевой формы с L-глутаминовой кислотой в сочетании со специальными фитосборами параллельно с лучевой терапией и комплексной химиотерапией до и после операции при лечении онкозаболеваний [23].

Возможность применения препарата «олигохит актив» в качестве средства для ингибирования роста опухоли в эксперименте была показана на модели лимфосаркомы Плисса.

Выбранная нами модель экспериментальной опухоли лимфосаркома Плисса (ЛФС), полученная в 1958 году после подкожной перевивки опухоли, возникшей у крысы, получавшей 3,3 дихлорбензидин, характеризуется следующими особенностями: состоит из мягких, округлой формы клеток, большая часть которых занята крупным ядром; хроматин располагается главным образом в периферической зоне ядра; ядрышки крупные, гиперхромные; цитоплазма отличается умеренной базофилией. Опухоль обладает ярко выраженным инфильтративным ростом в пограничные соединительную и жировую ткань, а также мышцы; метастазирует [18].

Способ ингибирования роста опухоли в эксперименте был разработан на модели лимфосаркома Плисса; он заключается в том, что животному до перевивки опухоли ежедневно per os дают раствор препарата «олигохит актив» концентрацией 90-100 мг/кг веса, общим курсом не менее 7 дней. Выбор дозы и курса введения обоснован как теоретическими данными, так и собственными экспериментальными исследованиями. В статье М.В.Васина с сотр. показано, что максимальный антитоксический и антиоксидантный эффект достигается при дозе ЯК 100 мг/кг веса [6]; а Н.И.Федотчева с сотр. выявили, что в гипометаболических состояниях эффективными дозами при введении сукцината перорально являются 50-100 мг/кг веса [25]. Срок введения веществ выбран как минимальный и соответствующий однократному введению для человека [21]. В наших исследованиях показано, что использование препарата «олигохит актив» в концентрации 90-100 мг/кг веса, общим курсом 7 дней, эффективно для коррекции морфологического состояния печени [30] и свободнорадикального баланса организма опухоленосителя.

Проведены исследования и выявлена эффективность применения препарата «олигохит актив» для ингибирования роста опухоли на модели лимфосаркома Плисса.

Эксперимент выполнен на 20 белых беспородных крысах, которые были разделены на две группы: контрольная и опытная.

1 группа – контрольная (n=10);

2 группа – опытная (n=10).

В опытной группе здоровым животным ежедневно per os вводили препарат олигохит актив из расчета 90-100 мг/кг веса, общим курсом 7 дней. Животные контрольной группы получали чистую воду по той же схеме.

Через день после отмены препарата животным контрольной и опытной групп в область правого бедра подкожно трансплантировали клетки опухолевого штамма лимфосаркомы (ЛФС) Плисса в 0.5 мл физиологического раствора. Штамм ЛФС Плисса (приобретен в ОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМП, Москва) – экспериментальная опухоль, полученная в 1958 году после подкожной перевивки опухоли, возникшей у крысы, получавшей 3,3-дихлорбензидин [10].

На 10, 12 и 19 сутки после трансплантации опухоли производили линейные замеры опухоли штангенциркулем. И вычисляли средний объем опухоли V (мм³) по формуле [21]:

V=(а·b²)/2, где а – длина, b – ширина.

Степень ингибирования роста опухоли определяли по показателю торможение роста опухоли, вычисляемого по формуле [21]:

ТРО=(Vконтроля-Vопыта)/Vконтроля·100%,

где V – средний объем опухоли (мм³) в подопытной и контрольной группах, соответственно, на конкретный срок.

Значимый противоопухолевый эффект должен сохраняться не менее 7 суток.

Количественные критерии оценки ингибирующего эффекта

При статистической обработке результатов для оценки значимости цифровых данных использовали t-критерий Стьюдента, используя поправку Бонферонни.

Полученные результаты показали, что применение олигосахарид хитозана сукцинат-аскорбата («олигохит актив») до перевивки опухолевого штамма ЛФС Плисса из расчета 90-100 мг/кг веса, общим курсом не менее 7 дней тормозит рост лимфосаркомы Плисса в среднем на 63.7% (табл.1), что способствует увеличению продолжительности жизни животных этой группы на 77.6% (табл.2).

Таблица 1.
Торможение роста лимфосаркомы Плисса на фоне введения «олигохит актив» до перевивки опухоли
Срок роста опухоли, дни	Объем опухоли в контрольной группе, см3		Объем опухоли в опытной группе, см3		ТРО, %
10	35,5±3,6		12,1±1,5*		65,9
12	75,6±6,4		30,9±2,6*		59,1
19	179,9±14,6		61,0±5,46*		66,1
* – различия достоверны при р0,05 по сравнению с контрольной группой.
Таблица 2.
Продолжительность жизни животных – опухоленосителей на фоне введения «олигохит актив» до перевивки лимфосаркомы Плисса. дни
Номера крыс		Контрольная группа		Опытная группа
1/31		17		31
2/32		19		32
3/33		20		37
4/34		18		39
5/35		22		38
6/36		23		30
7/37		20		31
8/38		20		37
9/39		18		38
10/40		20		37
Дни, М±m		19,7±1,83		35,0±3,52*
* – различия достоверны при р0,05 по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, изучение биологического действия препарата олигохит актив на экспериментальной модели перевивной опухоли выявило, что применение препарата «олигохит актив» до перевивки клеток опухоли приводит к ингибированию роста опухоли, что позволяет предложить применение данного способа для профилактики злокачественных новообразований домашних животных в ветеринарной практике и использования в медико-биологических исследованиях для разработки способов профилактики и лечения онкологических заболеваний.

Пример №1.

1) Крысе №10, весом 225 г в течение 7 дней внутрижелудочно с помощью зонда вводили чистую воду по 1 мл. На 9 день после начала манипуляций в область правого бедра подкожно трансплантировали клетки опухолевого штамма лимфосаркомы (ЛФС) Плисса в 0.5 мл физиологического раствора. Штамм ЛФС Плисса приобретен в НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (г.Москва).

На 10, 12 и 19 дни после трансплантации клеток ЛФС Плисса производили линейные замеры опухоли штангенциркулем и вычисляли средний объем опухоли V (мм³) по формуле [21]:

V=(а·b²)/2, где а – длина, b – ширина.

Объем опухоли увеличивался следующим образом: 10 день роста опухоли – 40 мм³; 12 день – 75 мм³; 19 день – 183 мм³.

Продолжительность жизни этого животного составила 20 дней.

2) Крысе №38, весом 220 г в течение 7 дней внутрижелудочно с помощью зонда вводили по 1 мл раствора «олигосахарид хитозана сукцинат-аскорбат» в дозе 90-100 мг/кг веса животного. На 9 день после начала манипуляций в область правого бедра подкожно трансплантировали клетки опухолевого штамма лимфосаркомы (ЛФС) Плисса в 0.5 мл физиологического раствора.

На 10, 12 и 19 дни после перевивки опухоли ее объем составил 11 мм³; 28 мм³ и 62 мм³, соответственно.

Степень ингибирования роста опухоли определяли по показателю торможение роста опухоли (ТРО) [21]:

ТРО=(Vконтроля-Vопыта)/Vконтроля·100%.

Введение «олигосахарид хитозана сукцинат-аскорбата» до перевивки ЛФС Плисса способствовало торможению роста опухоли на 72.5, 62.7 и 63.9%, соответственно выбранным срокам.

Продолжительность жизни животного №38 составила 37 дней.

Формула изобретения

1. Применение препарата “олигохит актив”, обладающего свойством ингибировать лимфосаркому Плисса.

2. Способ ингибирования роста лимфосаркомы Плисса в эксперименте, включающий введение препарата “олигохит актив” животным до перевивки лимфосаркомы Плисса per os ежедневно в дозе 90-100 мг/кг веса общим курсом не менее 7 дней.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 08.08.2008

Извещение опубликовано: 20.07.2010 БИ: 20/2010