Патент на изобретение №2319748
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ КОМПЛЕКСА MAIS (MYCOBACTERIUM AVIUM, M.INTRACELLULARE, M.SCROFULACEUM) И M.TUBERCULOSIS
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине. ДНК выделяют прогреванием микобактерий в течение 12 мин при 95°С в ТЕ-буфере рН 8,0. Полученные ампликоны обрабатывают рестриктазой Hin6I (объем ампликонов для рестрикции составляет 17 мкл и время рестрикции 1 час 10 мин). Продукты рестрикции разделяют в агарозном геле с последующим анализом профилей рестрикции изучаемых видов. Изобретение позволяет увеличивать сохранность ДНК и получать четкую картину рестрикционного анализа. 1 ил.
Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности к способу видовой идентификации комплекса MAIS (Mycobacterium avium, M.intracellulare, M.scrofulaceum («MAIS-диф.»)) и их отличия от M.tuberculosis. Для определения вида используют амплификацию фрагмента гена hsp65, который ответственен за синтез белка теплового шока, с последующим анализом полиморфизма профилей рестрикции ампликонов после их разделения в агарозе. Таким образом, определение вида микобактерии и, особенно, дифференциация М.tuberculosis от других видов имеет большое значение для выбора тактики лечения больного. Методы дифференциации микобактерий основаны на их культуральных, биохимических и генетических различиях. Культуральные тесты определения вида основаны на различиях в способности роста на питательных средах со специальными добавками, либо на том, что для разных видов микобактерий оптимальной является различная температура и они также отличаются разной скоростью роста. Главными недостатками этого метода являются длительность проведения исследования (до 2-3 месяцев), относительно невысокий процент получения достоверных результатов и трудности дифференциации вида нетуберкулезных микобактерий. Изложенное определяет актуальность предложенного изобретения и проведение работы направленной на разработку ускоренного обследования больных с хроническими заболеваниями легких. Аналогом данного изобретения являются два метода: метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) и метод рестрикционного анализа, в литературе этот подход называют геномным фингерпринтингом (Л.И.Патрушев. Экспрессия генов, М., «Наука». – 2000. – с.465-466.) Метод состоит из нескольких этапов: 1. Исследуемая последовательность ДНК изучаемого гена клонируется методом ПЦР. 2. Полученные ампликоны подвергаются воздействию рестриктаз, которые подбираются с помощью специальных программ, с учетом того, что фрагменты, на которые разрезаются полученные ампликоны, должны выявляться на агарозном геле. 3. Анализ полиморфизма профилей после разделения продуктов рестрикции в агарозном геле. Положение сайтов рестрикции в анализируемой последовательности нуклеотидов может иметь видоспецифический характер и служить точным генетическим маркером того или иного организма (Патрушев Л.И. 2000). На чертеже представлена фотография профилей рестрикции микобактерий комплекса MAIS и М.tuberculosis, выполненная с рестриктазой Hin 6 I. Из чертеже видно, что профиль рестрикции M.tuberculosis состоит из двух явно выраженных полос, M.avium и M.intracellulare так же из двух, но размеры рестрикционных фрагментов явно различаются между собой, М.scrofulaceum из 4 полос.
Формула изобретения
Способ идентификации вида микобактерий комплекса MAIS (M.avium, M.intracellulare, M-scrofulaceum) и M.tuberculosis, включающий этапы выделения ДНК, рестрикции, разделения продуктов рестрикции в агарозном геле с последующим анализом профилей рестрикции изучаемых видов, отличающийся тем, что ДНК выделяют прогреванием микобактерий 12 мин при 95°C в ТЕ-буфере рН 8,0, полученные ампликоны обрабатывают рестриктазой Hin6I (объем ампликонов для рестрикции составляет 17 мкл и время рестрикции 1 ч 10 мин).
РИСУНКИ
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Извещение опубликовано: 27.04.2009 БИ: 12/2009
|
||||||||||||||||||||||||||
