Патент на изобретение №2319744
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА, ГИСК № 147, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицинской вирусологии. Вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2), депонированный в коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича под №147 – реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса А/Малайзия/01/04 (H3N2) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2. Штамм активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 33°С, характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью, унаследовал от эпидемического вируса два гена, кодирующих поверхностные белки (гемагглютинин и нейраминидазу), и шесть генов, кодирующих негликозилированные белки от донора аттенуации. Штамм ареактогенен для детей и взрослых при интраназальном введении. 1 ил., 2 табл.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых и детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма А/17/Малайзия/04/11 (H3N2). Известный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Панама/99/242 (H3N2) – прототип [Патент РФ №2248395 от 11.07.2003. – Опубл. БИ 2005. – №8] – утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, аналогичным вирусу А/Малайзия/01/04 (H3N2). Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для производства живой гриппозной вакцины для взрослых и детей актуальной антигенной разновидности на основе современного эпидемического вируса А/Малайзия/01/04 (H3N2). Целью изобретения было получение промышленно значимого актуального вакцинного штамма для производства живой гриппозной вакцины. Для его получения выбраны два родительских штамма вируса гриппа (influenza, orthomyxoviridae): штамм А/Малайзия/01/04 (H3N2), характеризующийся актуальной антигенной структурой, и штамм А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), безвредный для человека донор аттенуации. Актуальный эпидемический вирус А/Малайзия/01/04 (H3N2) является аналогом широко циркулировавшего во всем мире штамма А/Веллингтон/01/04 (H3N2) [Материалы ВОЗ, 2004-2005 гг.], что определило целесообразность получения вакцинного штамма на его основе. Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), характеризующийся устаревшей антигенной структурой, был ранее получен из эпидемического вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2) методом холодовой адаптации [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. – СПб.: Наука. – 1994, – 151 с.], в результате чего он стал безвредным для человека, т.е. приобрел способность бессимптомно размножаться в верхних дыхательных путях привитых лиц, вызывая выработку противовирусного иммунитета. Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали следующие методы: а) Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), позволяющую определить принадлежность поверхностного антигена – гемагглютинина (НА) одному из родительских вирусов, для чего исследуемый вирус обрабатывается крысиными гипериммунными сыворотками против этих родительских вирусов. Подавление явления гемагглютинации при обработке одной из сывороток и будет говорить о том, от какого вируса унаследован ген гемагглютинина. На чертеже в качестве примера представлена рестрикция ДНК-копии фрагмента гена РА эндонуклеазой Vsp I. 1-я дорожка – ДНК маркер молекулярного веса; 2-я и 6-я дорожки – кандидат в вакцинные штаммы А/17/Малайзия/04/11 (H3N2); 3-я и 5-я дорожки – эпидемический вирус А/Малайзия/01/04 (H3N2); 4-я дорожка – донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). В РА гене донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) по сравнению с современными эпидемическими штаммами в позиции нуклеотида 107 имеется замена Т Результаты рестрикционного анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) представлены в табл.1. Полученный нами вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) в РТГА идентичен эпидемическому вирусу А/Малайзия/01/04 (H3N2), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Рестрикционным методом установлено, что вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) унаследовал как гены актуального штамма, так и гены донора аттенуации: все шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, M, NS) – от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); второй из двух генов, кодирующих поверхностные белки, – нейраминидазу (NA) – от эпидемического вируса А/Малайзия/01/04 (H3N2). Оценку биологических свойств вакцинного штамма А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) проводили путем параллельного титрования вируса в РКЭ при разных температурах. Таким образом было показано, что вакцинный вирус является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 40°С составляет 7,5 lg ЭИД50/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 25°С равна 3,5 lg ЭИД50/0,2 мл), что свидетельствует о его безвредности, поскольку по этим показателям он аналогичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Оценку токсичности вакцинного штамма А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) определяли путем подкожного и внутрибрюшинного введения вирусного материала мышам. Для этого группе из 10 мышей (самцов линии СВА весом 18-20 грамм) вводили соответствующим способом 0,5 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости с титром 106 lg ЭИД50/мл и оценивали патогенность вируса по проценту выживших мышей в течение 7 дней после введения вируса. Вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) в эксперименте на мышах оказался полностью безвредным – 100% мышей выжили в течение всего периода наблюдения. В результате эксперимента получен штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2), депонированный в коллекции ГИСК им. Л.А Тарасовича под №147 и который имеет характеристики, представленные в паспорте штамма. Характеристика штамма Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34°С в течение 48 часов – 8,5 lg ЭИД50/0,2 мл. Гемагглютинирующая активность – 1:1024. Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз). Паспорт штамма 1. Название штамма – А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) 2. Серия – серия 1 3. Метод получения – реассортация; характеристика родительских вирусов: а). эпидемический вирус – А/Малайзия/01/04 (H3N2) б). донор аттенуации – А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) 4. Количество пассажей – 5 в процессе реассортации 5. Характеристика штамма: а). оптимальные условия репродукции – 33°С, 48 часов; б). гемагглютинирующая активность-1:1024; в). инфекционная активность – 8.5 lg ЭИД50/0,2 мл; г). чувствительность к ингибиторам – ингибиторочувствительный в РТГА с нормальной лошадиной сывороткой; д). разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 40°С – 7.5 lg ЭИД50/0,2 мл; е). разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 25°С – 3.5 lg ЭИД50/0,2 мл. ж). структура генома реассортанта: – гены от эпидемического вируса – НА, NA – гены от донора аттенуации – РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS 6. Характеристика штамма после лиофилизации: а). дата лиофилизации – 03 февраля 2005 года; б). объем материала в ампуле – 1.0 мл; в). количество доз в серии – 4; г). инфекционная активность – 7.5 lg ЭИД50/0.2 мл; д). гемагглютинирующая активность – 1:256. 7. Рекомендуемое разведение при вакцинации – 1:2. 8. Антигенная специфичность а). гемагглютинина – идентичен вирусу А/Малайзия/01/04 (H3N2) по данным РТГА с иммунной крысиной антисывороткой; б). нейраминидазы – идентична вирусу А/Малайзия/01/04 (H3N2) по данным ПЦР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов. 9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении – безвреден. 10. Бактериологический контроль: дата проведения – 03 февраля 2005 года результат – стерилен. 11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов – посторонние вирусы отсутствуют. ШТАММ А/17/МАЛАЙЗИЯ/04/11 (H3N2) АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ДЕТЕЙ 3-14 ЛЕТ До 2004 года реассортантные вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для детей и для взрослых готовили на двух разных донорах аттенуации. Вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для взрослых – на доноре аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. – СПб.: Наука. – 1994, – 151 с.], а вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для детей – на гиператтенуированном доноре А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. – СПб.: Наука. – 1994, – 151 с.]. В 2003 году Комитет медицинских иммунобиологических препаратов счел целесообразным рекомендовать «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую для взрослых» для иммунизации детей в возрасте 3-6 лет с внесением соответствующих изменений в «Инструкцию по применению» препарата [Инструкция по применению вакцины гриппозной аллантоисной интраназальной живой сухой. Утверждена Главным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 16.06.2004]. В этой связи нами была изучена реактогенность вакцинного штамма А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) на детях в возрасте 3-14 лет. Пример 1. Группу из 21 ребенка в возрасте 3-14 лет вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл реассортантным вакцинным штаммом А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД50/мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 16 человек получила плацебо. Результаты исследований приведены в табл. 2. В группе вакцинированных детей сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С не наблюдались. Средние реакции в диапазоне 37,6-38,5°С наблюдались у одного ребенка (4,8% случаев). Слабые температурные реакции с кратковременным повышением температуры до 37,5°С были отмечены также в 4,8% случаев. В группе детей, получивших плацебо, сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С и слабые температурные реакции (37,1-37,5°С) не наблюдались. Средние температурные реакции в диапазоне 37,6-38,5°С отмечены у одного ребенка (6,3% случаев). Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%. Таким образом, испытания на детях подтвердили, что вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 от 26.03.2003 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения. На основе вышесказанного предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа может быть использован в производстве живой гриппозной вакцины для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста, что подтверждают результаты изучения его реактогенности для детей в возрасте 3-14 лет.
Формула изобретения
Штамм вируса гриппа, ГИСК №147, используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.
РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
С, приведшая к аминокислотной замене лейцина эпидемических вирусов на пролин у донора аттенуации, который имеет на этом участке сайт рестрикции для экзогенной рестриктазы Vsp I. У эпидемических вирусов этот рестрикционный сайт отсутствует. Таким образом, обработка исследуемых фрагментов ДНК данным ферментом приводит к разрезанию амплифицированного участка гена РВ2 на два более мелких фрагмента, если он происходит от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). В случае РА гена от эпидемического вируса – расщепления не происходит.
38,5°С)