Патент на изобретение №2319740
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) БИОПРЕПАРАТ-НЕФТЕДЕСТРУКТОР
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии. Биопрепарат-нефтедеструктор включает культуру бактерий и микробное удобрение-носитель в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержащее нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis. В качестве культуры бактерий использован штамм Bacillus cereus 3 К с титром 102 клеток/г носителя. Изобретение позволяет стимулировать развитие нефтеокисляющей микрофлоры, увеличить скорость разложения нефти, обеспечить интенсификацию микробных процессов, восстанавливающую агрохимические свойства почвы, совместить положительные свойства минеральных и органических удобрений, стимулировать развитие и рост растений, проводить очистку нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом. 7 табл.
(56) (продолжение): CLASS=”b560m”Спецвыпуск. 2004, с.27-31. МУРЫГИНА В.П. Очистка водной поверхности и грунтов от нефтяных загрязнений биопрепаратом “Родер”. Экология и промышленность России. 1999, с.16-19.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическому препарату на основе микробного удобрения (переработки отходов животноводческих комплексов) и на основе микроорганизмов-деструкторов (бактерий рода Bacillus), и может быть использован для очистки загрязненной нефтью и нефтепродуктами почвы при одновременном восстановлении ее физико-химических свойств и естественного биоценоза. Известен способ очистки почвы от нефтяных загрязнений смесью микроорганизмов и активного ила, RU №2198748 C1, B09C 1/10, C02F 3/34, C12N 1/20, 2003.02.20. Известно бактериальное удобрение, содержащее в качестве микроорганизма клетки Bacillus mucilaqinosus, RU №2157798 C2, C05F 11/08, 2000.10.20. Известно бактеризованное удобрение, включающее гуминосодержащую основу и бактериальную добавку из группы бактерий: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus polymyxa, RU №2186049 C2, C05F 11/08, C12N 1/20, C12R 1/07, 2002.07.27. В бактериальной добавке использован штамм Bacillus cereus 138Д в количестве 5,0·106 клеток/г основы. Известны штаммы бактерий, используемые для очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений, в частности Bacillus sp., см. патенты Российской Федерации RU №2083667 С1, C12N 1/20, В09С 1/10, C02F 3/34, 1997.07.10; RU №2115629 С1, C02F 3/34, В09С 1/10, 1998.07.20; RU №2182529 С1, В09С 1/10, C02F 3/34, C12N 1/20, C12N 1/26, 2002.05.20; RU №2204597 C2, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, 2003.05.20. Известен штамм Bacillus cereus В 3б ГКМ ВИЗР 98, RU №2157843 С1, C12N 1/26, В09С 1/10, C12R 1/085, 2000.10.20. Известен биопрепарат, содержащий нефтеокисляющий штамм Rhodococcus erythropolis, SU №1805097 A1, C02F 3/34, E02B 15/04, 1993.03.30. Известен состав для очистки почвы от нефтяных загрязнений, содержащий нефтеокисляющие микроорганизмы и комплексное удобрение, RU №2112610 C1, B09C 1/10, C02F 3/34, C12N 1/26, 1998.06.10. Известен способ получения биологически активного удобрения путем смешения навозосодержащих сточных вод с рециркуляционным активным илом с последующей аэробной обработкой, SU №1757209 A3, C05F 3/00, 2000.01.27. Все известные биопрепараты обладают низкой деструктирующей способностью. Данное техническое решение принято в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения. Однако оно обладает недостатками. Микробное удобрение Бамил ближайшего аналога содержит микроорганизмы-нефтедеструкторы, а также обладает положительными свойствами минеральных и органических удобрений, но нефтедеструктирующая активность его не обеспечивает возможности проводить нефтеочистку почв в районах с коротким тепловым периодом. Кроме того, титр микроорганизмов в микробном удобрении Бамил ближайшего аналога низок и при внесении его в обычные почвы не происходит значительного увеличения их численности. В основу настоящего изобретения положено решение технической задачи, позволяющей создать эффективный биопрепарат-нефтедеструктор комплексного действия: – с высокой нефтедеструктирующей активностью, – с положительными свойствами минеральных и органических удобрений, – с простым и рентабельным режимом получения, – с предпочтительной возможностью использования для очистки нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом. Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что биопрепарат-нефтедеструктор включает культуру бактерий и микробное удобрение-носитель в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержащее нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis. В качестве культуры бактерий использован штамм Bacillus cereus 3 К с титром 1012 клеток/г микробного удобрения. Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна». За счет реализации отличительных признаков изобретения /в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы/ достигаются важные новые свойства объекта. В предложенном техническом решении совместное использование микробного удобрения Бамил, обогащенного микроорганизмами-алканотрофами, численность которых приближается к техногенной почве, загрязненной нефтью, и стимулирующего развитие нативной, нефтеокисляющей микрофлоры, и микроорганизмов-нефтедеструкторов (бактерий штамма Bacillus cereus 3 К) позволяет получить эффективный биопрепарат-нефтедеструктор с высокой нефтедеструктирующей активностью. Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат, в связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень». Сущность изобретения заключается в следующем. Биопрепарат-нефтедеструктор включает культуру бактерий и микробное удобрение-носитель в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержащее нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis. В качестве культуры бактерий использован штамм Bacillus cereus 3 К с титром 1012 клеток/г микробного удобрения. Микробное удобрение Бамил получают путем смешивания навозосодержащих сточных вод с рециркуляционным активным илом; аэробной переработки при нагрузке на ил 70-225 мг ХПГ/г ч и скорости роста ила 0,01-0,02 ч-1 до достижения загрязнения сточной воды по ХПК на 40%-70%; отделения избыточного активного ила, его уплотнения и сушки при температуре 170-190°С. Культура бактерий штамма Bacillus cereus шт. 3 К депонирована в ГНУ ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ микробиологии РАСХН и ООО НТЦ «Ника», 2003 г., (дата заполнения 25.11.03). Штамм Bacillus cereus шт. 3 К депонирован в качестве производственного штамма для изготовления биопрепарата-нефтедеструктора под регистрационным номером «ВНИИСХМ Д143» от 24 декабря 2003 г. Культура бактерий штамма Bacillus cereus 3 К выделена из техногенной почвы, загрязненной дизельным топливом (г.Санкт-Петербург). Из техногенной почвы на территории Кировского завода в районе ТЭЦ (г.Санкт-Петербург) были взяты образцы. Выделение проводили посевом (методом серийных разведений) на плотную питательную среду Придхем-Готлиба, в которой единственным источником углерода использована сырая нефть. Условия культивирования – рост обильный, на питательной среде с панкриатическим гидролизом кильки (СПА), температура 25-27°С, аэроб. Пигментация культуры – отсутствует. Форма колоний – амебоидная, неправильной формы, профиль плоский, край волнистый, складчатая, беловатая. Форма и размер вегетативных клеток – палочки, палочки с закругленными концами, размером 0,6-0,8×1,9-2,6 мкм. Спорообразование – споры элипсовидные, расположение центральное, не изменяют форму клетки, размером 0,6-0,8×1,2-2,1 мкм. Подвижность клеток – подвижность в вегетативном состоянии. Жгутикование – перетрихиальное. Окрашивание по Грамму – Грам+ Отношение к источнику углерода – утилизирует мальтозу, сахарозу, маннозу, глюкозу, лактозу, инозан, рацимозу, сорбит, ксилозу, арабинозу, глицерин, маннит, галактозу, рамнозу. Отношение к источнику азота – хороший рост на средах с миниральными и органическими источниками азота (NH3·NO3, пептон, аспаратин). Другие диагностические признаки – образует каталазу, лицетиназу; реакция Вогес-Проскауэра – положительная, индол не образует, глюкозу использует слабо без образования газа, рост при 60°С отсутствует, ризоидные колонии и параспоральные включения. Культура бактерий штамма Bacillus cereus 3 К обладает высокой углеводородокисляющей активностью: способна утилизировать сырую нефть в почве. Штамм Bacillus cereus 3 К используют в биопрепарате-нефтедеструкторе на основе микробного удобрения Бамил. Сущность изобретения поясняется примерами. ПРИМЕР 1. Биоорганические носители: – микробное удобрение Бамил в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержит нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis; – активный ил, образующийся при очистке сточных вод, содержащий большое количество углеводородокисляющих микроорганизмов и имеющий вязкость – 1,5·10-6 м3/с; взвешенные частицы – 12,0 г/л; сырой протеин – 50%; углеводы – 10%; микроорганизмы: бактерии, актиномицеты, нитрификаторы, плесневые грибы, дрожжи, целлюлозоразрушающие анаэробы. Физические и химические характеристики удобрений представлены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что микробное удобрение Бамил, имея более низкую влагоемкость, чем активный ил, обладает практически одинаковой с ним адсорбционной емкостью. ПРИМЕР 2. Биоорганические носители: – микробное удобрение Бамил в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержит нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis; – активный ил, образующийся при очистке сточных вод, содержащий большое количество углеводородокисляющих микроорганизмов и имеющий вязкость – 1,5·10-6 м3/с; взвешенные частицы – 12,0 г/л; сырой протеин – 50%; углеводы – 10%; микроорганизмы: бактерии, актиномицеты, нитрификаторы, плесневые грибы, дрожжи, целлюлозоразрушающие анаэробы. Численность трофических групп бактерий в носителях определяют методом Коха: посев носителей на питательную среду Придхем-Готлиба. В качестве единственного источника углерода используют нефть – 1%. Минеральная среда Придхем-Готлиба, г/л: (NH4)2SO4 – 2,64; K2HPO4 – 5,65; KH2PO4 – 2,38; MgSO4·7H2O – 1,0; CuSO4 – 0,064; FeSO4 – 0,01; MnCl2 – 0,079; ZnSO4 – 0,015. Бактерии-аммонификаторы учитывают на сухом питательном агаре (СПА), олигонитрофилы – на среде Эшби. Результаты представлены в таблице 2. Из таблицы 2 очевидно, что в микробном удобрении Бамил содержатся микроорганизмы, утилизирующие сырую нефть (численность алканотрофов 8,3·104 клеток/г). ПРИМЕР 3. Из нефтезагрязненных почв (40 лет загрязнения дизельным топливом) изолируют бактерии штамма Bacillus cereus 3 К, способные расти с сырой нефтью в качестве единственного источника углерода. Культуры бактерий – аналоги: – производственная культура Bacillus subtilis шт.2843, – производственная культура Rhodococcus erythropolis шт.1231. Проводят анализ нефтедеструктирующей активности почвенных бактерий методом флуоресцентной спектроскопии. Результаты анализа приведены в таблице 3. Из таблицы 3 видно, что наибольшая степень деструкции нефти у бактерий штамма Bacillus cereus 3 К. Примечание: Контроль – питательная среда Придхем-Готлиба с 1% нефти. Из таблиц 3 и 1 видно, что степень деструкции нефти у бактерий штамма Bacillus cereus 3 К в 1,7 раза выше, чем у микробного удобрения Бамил (ближайший аналог). ПРИМЕР 4. Бактерии штамма Bacillus cereus 3 К наращивают на плотном сухом питательном агаре в течение 3-х суток. Создают водную суспензию бактерий штамма Bacillus cereus 3 К с титром 106 клеток/г. На поверхности 1 м2 распределяют 1 кг воздушно-сухого микробного удобрения Бамил, распрыскивают 100 мл суспензии бактерий штамма Bacillus cereus 3 К с титром 1013 клеток/г и получают биопрепарат, содержащий бактерии штамма Bacillus cereus 3 К с титром 1012 клеток/г микробного удобрения Бамил. ПРИМЕР 5. Закладку полевого эксперимента проводят на опытном участке в лизиметрах. В почву вкапывают (на уровне с поверхностью участка) пятилитровые лизиметры с подзолистой почвой и заливают нефть из расчета 24 л/м2 (0,45 л нефти/1 лизиметр). Через сутки добавляют 50 г биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил. Образцы анализируют через 30 и 50 дней. Содержание нефти определяют весовым методом. Динамика содержания нефти в почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил представлена в таблице 4. Из таблицы 4 видно, что естественное разрушение нефти в почве нативной микрофлорой шло очень медленно (деструкция нефти в почве составила 8%), внесение биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил разрушило нефть на 86%. Примечание: 1. Контроль – почва дерново-подзолистая. 2. Нефтезагрязненная почва (18% нефти). 3. Замеры проводят через 50 дней после закладки опыта. ПРИМЕР 6. Закладку полевого эксперимента проводят на опытном участке в лизиметрах. В почву вкапывают (на уровне с поверхностью участка) пятилитровые лизиметры с подзолистой почвой и заливают нефть из расчета 24 л/м2 (0,45 л нефти/1 лизиметр). Через сутки добавляют 50 г биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил. Образцы анализируют через 30 и 50 дней. Численность бактерий-алканотрофов в нефтезагрязненной почве и в нефтезагрязненной почве с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Бамил определяют методом Коха: посев носителей на питательную среду Придхем-Готлиба. В качестве единственного источника углерода используют нефть – 1%. Минеральная среда Придхем-Готлиба, г/л: (NH4)2SO4 – 2,64; K2HPO4 – 5,65; KH2PO4 – 2,38; MgSO4·7H2O – 1,0; CuSO4 – 0,064; FeSO4 – 0,01; MnCl2 – 0,079; ZnSO4 – 0,015. Динамика численности бактерий-алканотрофов в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил представлена в таблице 5. Из таблицы 5 видно, что в нефтезагрязненной почве с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Бамил численность бактерий-алканотрофов увеличилась в среднем на 70% по сравнению с нефтезагрязненной почвой. Примечание: 1. Контроль – почва дерново-подзолистая. 2. Нефтезагрязненная почва (18% нефти). 3. Замеры проводились через 50 дней после закладки опыта. ПРИМЕР 7. Закладку полевого эксперимента проводят на опытном участке в лизиметрах. В почву вкапывают (на уровне с поверхностью участка) пятилитровые лизиметры с подзолистой почвой и заливают нефть из расчета 24 л/м2 (0,45 л нефти/1 лизиметр). Через сутки добавляют 50 г биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил. Образцы анализируют через 30 и 50 дней. Биологическую активность нефтезагрязненной почвы и нефтезагрязненной почвы с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Бамил оценивают по интенсивности выделения ими СО2. CO2 определяют газохроматографическим методом. Навеску почвы массой 20 г (в расчете на абсолютно сухой вес) помещают в склянки объемом 120 мл, закрывают ватной пробкой и инкубируют во влажной камере при температуре 27°С. Интенсивность выделения СО2 определяют через 3-е суток. Для этого склянки «промывают» сжатым воздухом в течение 3-х минут и герметически закрывают пластмассовыми крышками с эластичными резиновыми прокладками. Инкубируют 24 часа в термостате при температуре 27°С. После этого медицинским шприцом отбирают пробы газа объемом 0,5 мл и вводят их в приемник газового хроматографа (Хром-4), предварительно делают его калибровку. Для хроматографии используют сорбционные колонки из нержавеющей стали длиной 120 см с внутренним диаметром 2 мм, наполненные сорбентом полисорб-1. В качестве газа применяют гелий, который пропускают со скоростью 20 мм/мин. Температура термостата детектора 100°С. Температура камеры и колонок 20°С-22°С. Выход СО2 происходит на 48-й секунде, на хроматографе появляется четкий пик, фиксирующий выход CO2. Интенсивность выделения CO2 в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил представлена в таблице 6. Из таблицы 6 видно, что в нефтезагрязненной почве с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Бамил СО2 выделяется в 11 раз больше по сравнению с контролем. Примечание: Контроль – нефтезагрязненная почва. ПРИМЕР 8. Закладку полевого эксперимента проводят на опытном участке в лизиметрах. В почву вкапывают (на уровне с поверхностью участка) пятилитровые лизиметры с подзолистой почвой и заливают нефть из расчета 24 л/м2 (0,45 л нефти/1 лизиметр). Через сутки добавляют 50 г биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил. Образцы анализируют через 30 и 50 дней. Через 50 дней очистки почвы от нефтезагрязнений проводят исследование почв на фитотоксическую активность. Оценку почвы на фитотоксическую активность осуществляют по развитию овса в 200 мл сосудах. Во время проведения опыта поддерживают постоянный уровень влажности и проводят микробиологические и фенологические наблюдения. Динамика развития проростков овса представлена в таблице 7. Из таблицы 7 видно, что в нефтезагрязненной почве наблюдается значительное ингибирование развития овса, так всхожесть семян снизилась в 16 раз, длина стебля и корня в 3 раза по сравнению с контролем, при внесении биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил масса стеблей увеличилась на 33%-53%, длина стебля и корня возросла в 4,5 раза по сравнению с нефтезагрязненной почвой. Примечание: 1. Контроль – почва дерново-подзолистая. 2. Нефтезагрязненная почва (18% нефти). 3. В каждом варианте опыта оценено по 20 растений овса. Пример 8 подтверждает, что биопрепарат-нефтедеструктор, полученный путем иммобилизации клеток бактерий (штамма Bacillus cereus 3 К) на микробное удобрение Бамил, обладает не только нефтедеструктирующей активностью, но способствует росту растений. Приведенные примеры подтверждают, что биопрепарат-нефтедеструктор, полученный путем иммобилизации бактерий штамма Bacillus cereus 3 К на микробное удобрение Бамил, является перспективным биологическим препаратом, способным интенсифицировать микробные процессы в почве, и имеет нефтедеструктирующую активность почти в два раза выше, чем у ближайшего аналога. Предложенный биопрепарат-нефтедеструктор на основе микробного удобрения Бамил использовался для обработки загрязненных нефтью почв в условиях Крайнего Севера и на аварийных разливах дизельного топлива Ленинградской области, наблюдения за динамикой процессов в нефтезагрязненной почве и оценка активизации восстановления почв при введении этого биопрепарата подтверждают его соответствие критерию «промышленная применимость». Использование эффективного биопрепарата-нефтедеструктора для очистки нефтезагрязненных почв позволяет: – повысить нефтедеструктирующую активность, – стимулировать развитие нефтеокисляющей микрофлоры, – увеличить скорость разложения нефти, – обеспечить интенсификацию микробных процессов, восстанавливающую агрохимические свойства почвы, – совместить положительные свойства минеральных и органических удобрений, – стимулировать развитие и рост растений, – проводить очистку нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом.
Формула изобретения
Биопрепарат-нефтедеструктор, включающий культуру бактерий и микробное удобрение-носитель в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержащее нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis, отличающийся тем, что в качестве культуры бактерий использован штамм Bacillus cereus 3 К с титром 1012 клеток/г удобрения.
TK4A – Поправки к публикациям сведений об изобретениях в бюллетенях “Изобретения (заявки и патенты)” и “Изобретения. Полезные модели”
Напечатано: Адрес для переписки: 196608, Санкт-Петербург, Пушкин-8, ш.Подбельского, 3, Лаборатория микробной экотехнологии Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, И.А.Архипченко
Следует читать: Адрес для переписки: 169710, Республика Коми, г. Усинск, ул. Нефтяников, 31, ООО «ЛУКОЙЛ-Коми», В.Н.Зузлову
Номер и год публикации бюллетеня: 8-2008
Код раздела: FG4A
Извещение опубликовано: 27.04.2008 БИ: 12/2008
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||