Патент на изобретение №2319740

(54) БИОПРЕПАРАТ-НЕФТЕДЕСТРУКТОР

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Биопрепарат-нефтедеструктор включает культуру бактерий и микробное удобрение-носитель в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержащее нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis. В качестве культуры бактерий использован штамм Bacillus cereus 3 К с титром 10² клеток/г носителя. Изобретение позволяет стимулировать развитие нефтеокисляющей микрофлоры, увеличить скорость разложения нефти, обеспечить интенсификацию микробных процессов, восстанавливающую агрохимические свойства почвы, совместить положительные свойства минеральных и органических удобрений, стимулировать развитие и рост растений, проводить очистку нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом. 7 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”Спецвыпуск. 2004, с.27-31. МУРЫГИНА В.П. Очистка водной поверхности и грунтов от нефтяных загрязнений биопрепаратом “Родер”. Экология и промышленность России. 1999, с.16-19.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическому препарату на основе микробного удобрения (переработки отходов животноводческих комплексов) и на основе микроорганизмов-деструкторов (бактерий рода Bacillus), и может быть использован для очистки загрязненной нефтью и нефтепродуктами почвы при одновременном восстановлении ее физико-химических свойств и естественного биоценоза.

Известен способ очистки почвы от нефтяных загрязнений смесью микроорганизмов и активного ила, RU №2198748 C1, B09C 1/10, C02F 3/34, C12N 1/20, 2003.02.20.

Известно бактериальное удобрение, содержащее в качестве микроорганизма клетки Bacillus mucilaqinosus, RU №2157798 C2, C05F 11/08, 2000.10.20.

Известно бактеризованное удобрение, включающее гуминосодержащую основу и бактериальную добавку из группы бактерий: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus polymyxa, RU №2186049 C2, C05F 11/08, C12N 1/20, C12R 1/07, 2002.07.27. В бактериальной добавке использован штамм Bacillus cereus 138Д в количестве 5,0·10⁶ клеток/г основы.

Известны штаммы бактерий, используемые для очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений, в частности Bacillus sp., см. патенты Российской Федерации RU №2083667 С1, C12N 1/20, В09С 1/10, C02F 3/34, 1997.07.10; RU №2115629 С1, C02F 3/34, В09С 1/10, 1998.07.20; RU №2182529 С1, В09С 1/10, C02F 3/34, C12N 1/20, C12N 1/26, 2002.05.20; RU №2204597 C2, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, 2003.05.20.

Известен штамм Bacillus cereus В 3б ГКМ ВИЗР 98, RU №2157843 С1, C12N 1/26, В09С 1/10, C12R 1/085, 2000.10.20.

Известен биопрепарат, содержащий нефтеокисляющий штамм Rhodococcus erythropolis, SU №1805097 A1, C02F 3/34, E02B 15/04, 1993.03.30.

Известен состав для очистки почвы от нефтяных загрязнений, содержащий нефтеокисляющие микроорганизмы и комплексное удобрение, RU №2112610 C1, B09C 1/10, C02F 3/34, C12N 1/26, 1998.06.10.

Известен способ получения биологически активного удобрения путем смешения навозосодержащих сточных вод с рециркуляционным активным илом с последующей аэробной обработкой, SU №1757209 A3, C05F 3/00, 2000.01.27.

Все известные биопрепараты обладают низкой деструктирующей способностью.

Данное техническое решение принято в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения.

Однако оно обладает недостатками.

Микробное удобрение Бамил ближайшего аналога содержит микроорганизмы-нефтедеструкторы, а также обладает положительными свойствами минеральных и органических удобрений, но нефтедеструктирующая активность его не обеспечивает возможности проводить нефтеочистку почв в районах с коротким тепловым периодом. Кроме того, титр микроорганизмов в микробном удобрении Бамил ближайшего аналога низок и при внесении его в обычные почвы не происходит значительного увеличения их численности.

В основу настоящего изобретения положено решение технической задачи, позволяющей создать эффективный биопрепарат-нефтедеструктор комплексного действия:

– с высокой нефтедеструктирующей активностью,

– с положительными свойствами минеральных и органических удобрений,

– с простым и рентабельным режимом получения,

– с предпочтительной возможностью использования для очистки нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что биопрепарат-нефтедеструктор включает культуру бактерий и микробное удобрение-носитель в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержащее нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis.

В качестве культуры бактерий использован штамм Bacillus cereus 3 К с титром 10¹² клеток/г микробного удобрения.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

За счет реализации отличительных признаков изобретения /в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы/ достигаются важные новые свойства объекта.

В предложенном техническом решении совместное использование микробного удобрения Бамил, обогащенного микроорганизмами-алканотрофами, численность которых приближается к техногенной почве, загрязненной нефтью, и стимулирующего развитие нативной, нефтеокисляющей микрофлоры, и микроорганизмов-нефтедеструкторов (бактерий штамма Bacillus cereus 3 К) позволяет получить эффективный биопрепарат-нефтедеструктор с высокой нефтедеструктирующей активностью.

Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат, в связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Сущность изобретения заключается в следующем.

Биопрепарат-нефтедеструктор включает культуру бактерий и микробное удобрение-носитель в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержащее нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis.

В качестве культуры бактерий использован штамм Bacillus cereus 3 К с титром 10¹² клеток/г микробного удобрения.

Микробное удобрение Бамил получают путем смешивания навозосодержащих сточных вод с рециркуляционным активным илом; аэробной переработки при нагрузке на ил 70-225 мг ХПГ/г ч и скорости роста ила 0,01-0,02 ч^-1 до достижения загрязнения сточной воды по ХПК на 40%-70%; отделения избыточного активного ила, его уплотнения и сушки при температуре 170-190°С.

Культура бактерий штамма Bacillus cereus шт. 3 К депонирована в ГНУ ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ микробиологии РАСХН и ООО НТЦ «Ника», 2003 г., (дата заполнения 25.11.03).

Штамм Bacillus cereus шт. 3 К депонирован в качестве производственного штамма для изготовления биопрепарата-нефтедеструктора под регистрационным номером «ВНИИСХМ Д143» от 24 декабря 2003 г.

Культура бактерий штамма Bacillus cereus 3 К выделена из техногенной почвы, загрязненной дизельным топливом (г.Санкт-Петербург).

Из техногенной почвы на территории Кировского завода в районе ТЭЦ (г.Санкт-Петербург) были взяты образцы. Выделение проводили посевом (методом серийных разведений) на плотную питательную среду Придхем-Готлиба, в которой единственным источником углерода использована сырая нефть.

Условия культивирования – рост обильный, на питательной среде с панкриатическим гидролизом кильки (СПА), температура 25-27°С, аэроб.

Пигментация культуры – отсутствует.

Форма колоний – амебоидная, неправильной формы, профиль плоский, край волнистый, складчатая, беловатая.

Форма и размер вегетативных клеток – палочки, палочки с закругленными концами, размером 0,6-0,8×1,9-2,6 мкм.

Спорообразование – споры элипсовидные, расположение центральное, не изменяют форму клетки, размером 0,6-0,8×1,2-2,1 мкм.

Подвижность клеток – подвижность в вегетативном состоянии.

Жгутикование – перетрихиальное.

Окрашивание по Грамму – Грам⁺

Отношение к источнику углерода – утилизирует мальтозу, сахарозу, маннозу, глюкозу, лактозу, инозан, рацимозу, сорбит, ксилозу, арабинозу, глицерин, маннит, галактозу, рамнозу.

Отношение к источнику азота – хороший рост на средах с миниральными и органическими источниками азота (NH₃·NO₃, пептон, аспаратин).

Другие диагностические признаки – образует каталазу, лицетиназу; реакция Вогес-Проскауэра – положительная, индол не образует, глюкозу использует слабо без образования газа, рост при 60°С отсутствует, ризоидные колонии и параспоральные включения.

Культура бактерий штамма Bacillus cereus 3 К обладает высокой углеводородокисляющей активностью: способна утилизировать сырую нефть в почве. Штамм Bacillus cereus 3 К используют в биопрепарате-нефтедеструкторе на основе микробного удобрения Бамил.

Сущность изобретения поясняется примерами.

ПРИМЕР 1.

Биоорганические носители:

– микробное удобрение Бамил в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержит нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis;

– активный ил, образующийся при очистке сточных вод, содержащий большое количество углеводородокисляющих микроорганизмов и имеющий вязкость – 1,5·10^-6 м³/с; взвешенные частицы – 12,0 г/л; сырой протеин – 50%; углеводы – 10%; микроорганизмы: бактерии, актиномицеты, нитрификаторы, плесневые грибы, дрожжи, целлюлозоразрушающие анаэробы.

Физические и химические характеристики удобрений представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что микробное удобрение Бамил, имея более низкую влагоемкость, чем активный ил, обладает практически одинаковой с ним адсорбционной емкостью.

ПРИМЕР 2.

Биоорганические носители:

– микробное удобрение Бамил в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержит нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis;

– активный ил, образующийся при очистке сточных вод, содержащий большое количество углеводородокисляющих микроорганизмов и имеющий вязкость – 1,5·10^-6 м³/с; взвешенные частицы – 12,0 г/л; сырой протеин – 50%; углеводы – 10%; микроорганизмы: бактерии, актиномицеты, нитрификаторы, плесневые грибы, дрожжи, целлюлозоразрушающие анаэробы.

Численность трофических групп бактерий в носителях определяют методом Коха: посев носителей на питательную среду Придхем-Готлиба. В качестве единственного источника углерода используют нефть – 1%.

Минеральная среда Придхем-Готлиба, г/л: (NH₄)₂SO₄ – 2,64; K₂HPO₄ – 5,65; KH₂PO₄ – 2,38; MgSO₄·7H₂O – 1,0; CuSO₄ – 0,064; FeSO₄ – 0,01; MnCl₂ – 0,079; ZnSO₄ – 0,015.

Бактерии-аммонификаторы учитывают на сухом питательном агаре (СПА), олигонитрофилы – на среде Эшби.

Результаты представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 очевидно, что в микробном удобрении Бамил содержатся микроорганизмы, утилизирующие сырую нефть (численность алканотрофов 8,3·10⁴ клеток/г).

ПРИМЕР 3.

Из нефтезагрязненных почв (40 лет загрязнения дизельным топливом) изолируют бактерии штамма Bacillus cereus 3 К, способные расти с сырой нефтью в качестве единственного источника углерода.

Культуры бактерий – аналоги:

– производственная культура Bacillus subtilis шт.2843,

– производственная культура Rhodococcus erythropolis шт.1231.

Проводят анализ нефтедеструктирующей активности почвенных бактерий методом флуоресцентной спектроскопии.

Результаты анализа приведены в таблице 3.

Из таблицы 3 видно, что наибольшая степень деструкции нефти у бактерий штамма Bacillus cereus 3 К.

Примечание:

Контроль – питательная среда Придхем-Готлиба с 1% нефти.

Из таблиц 3 и 1 видно, что степень деструкции нефти у бактерий штамма Bacillus cereus 3 К в 1,7 раза выше, чем у микробного удобрения Бамил (ближайший аналог).

ПРИМЕР 4.

Бактерии штамма Bacillus cereus 3 К наращивают на плотном сухом питательном агаре в течение 3-х суток. Создают водную суспензию бактерий штамма Bacillus cereus 3 К с титром 10⁶ клеток/г. На поверхности 1 м² распределяют 1 кг воздушно-сухого микробного удобрения Бамил, распрыскивают 100 мл суспензии бактерий штамма Bacillus cereus 3 К с титром 10¹³ клеток/г и получают биопрепарат, содержащий бактерии штамма Bacillus cereus 3 К с титром 10¹² клеток/г микробного удобрения Бамил.

ПРИМЕР 5.

Закладку полевого эксперимента проводят на опытном участке в лизиметрах. В почву вкапывают (на уровне с поверхностью участка) пятилитровые лизиметры с подзолистой почвой и заливают нефть из расчета 24 л/м² (0,45 л нефти/1 лизиметр). Через сутки добавляют 50 г биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил. Образцы анализируют через 30 и 50 дней.

Содержание нефти определяют весовым методом.

Динамика содержания нефти в почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил представлена в таблице 4.

Из таблицы 4 видно, что естественное разрушение нефти в почве нативной микрофлорой шло очень медленно (деструкция нефти в почве составила 8%), внесение биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил разрушило нефть на 86%.

Примечание:

1. Контроль – почва дерново-подзолистая.

2. Нефтезагрязненная почва (18% нефти).

3. Замеры проводят через 50 дней после закладки опыта.

ПРИМЕР 6.

Закладку полевого эксперимента проводят на опытном участке в лизиметрах. В почву вкапывают (на уровне с поверхностью участка) пятилитровые лизиметры с подзолистой почвой и заливают нефть из расчета 24 л/м² (0,45 л нефти/1 лизиметр). Через сутки добавляют 50 г биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил. Образцы анализируют через 30 и 50 дней.

Численность бактерий-алканотрофов в нефтезагрязненной почве и в нефтезагрязненной почве с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Бамил определяют методом Коха: посев носителей на питательную среду Придхем-Готлиба. В качестве единственного источника углерода используют нефть – 1%.

Минеральная среда Придхем-Готлиба, г/л: (NH₄)₂SO₄ – 2,64; K₂HPO₄ – 5,65; KH₂PO₄ – 2,38; MgSO₄·7H₂O – 1,0; CuSO₄ – 0,064; FeSO₄ – 0,01; MnCl₂ – 0,079; ZnSO₄ – 0,015.

Динамика численности бактерий-алканотрофов в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил представлена в таблице 5.

Из таблицы 5 видно, что в нефтезагрязненной почве с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Бамил численность бактерий-алканотрофов увеличилась в среднем на 70% по сравнению с нефтезагрязненной почвой.

Примечание:

1. Контроль – почва дерново-подзолистая.

2. Нефтезагрязненная почва (18% нефти).

3. Замеры проводились через 50 дней после закладки опыта.

ПРИМЕР 7.

Закладку полевого эксперимента проводят на опытном участке в лизиметрах. В почву вкапывают (на уровне с поверхностью участка) пятилитровые лизиметры с подзолистой почвой и заливают нефть из расчета 24 л/м² (0,45 л нефти/1 лизиметр). Через сутки добавляют 50 г биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил. Образцы анализируют через 30 и 50 дней.

Биологическую активность нефтезагрязненной почвы и нефтезагрязненной почвы с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Бамил оценивают по интенсивности выделения ими СО₂.

CO₂ определяют газохроматографическим методом.

Навеску почвы массой 20 г (в расчете на абсолютно сухой вес) помещают в склянки объемом 120 мл, закрывают ватной пробкой и инкубируют во влажной камере при температуре 27°С. Интенсивность выделения СО₂ определяют через 3-е суток. Для этого склянки «промывают» сжатым воздухом в течение 3-х минут и герметически закрывают пластмассовыми крышками с эластичными резиновыми прокладками. Инкубируют 24 часа в термостате при температуре 27°С. После этого медицинским шприцом отбирают пробы газа объемом 0,5 мл и вводят их в приемник газового хроматографа (Хром-4), предварительно делают его калибровку. Для хроматографии используют сорбционные колонки из нержавеющей стали длиной 120 см с внутренним диаметром 2 мм, наполненные сорбентом полисорб-1. В качестве газа применяют гелий, который пропускают со скоростью 20 мм/мин. Температура термостата детектора 100°С. Температура камеры и колонок 20°С-22°С. Выход СО₂ происходит на 48-й секунде, на хроматографе появляется четкий пик, фиксирующий выход CO₂.

Интенсивность выделения CO₂ в нефтезагрязненной почве в зависимости от внесения биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил представлена в таблице 6.

Из таблицы 6 видно, что в нефтезагрязненной почве с внесенным биопрепаратом-нефтедеструктором на основе микробного удобрения Бамил СО₂ выделяется в 11 раз больше по сравнению с контролем.

Примечание:

Контроль – нефтезагрязненная почва.

ПРИМЕР 8.

Закладку полевого эксперимента проводят на опытном участке в лизиметрах. В почву вкапывают (на уровне с поверхностью участка) пятилитровые лизиметры с подзолистой почвой и заливают нефть из расчета 24 л/м² (0,45 л нефти/1 лизиметр). Через сутки добавляют 50 г биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил. Образцы анализируют через 30 и 50 дней.

Через 50 дней очистки почвы от нефтезагрязнений проводят исследование почв на фитотоксическую активность.

Оценку почвы на фитотоксическую активность осуществляют по развитию овса в 200 мл сосудах. Во время проведения опыта поддерживают постоянный уровень влажности и проводят микробиологические и фенологические наблюдения.

Динамика развития проростков овса представлена в таблице 7. Из таблицы 7 видно, что в нефтезагрязненной почве наблюдается значительное ингибирование развития овса, так всхожесть семян снизилась в 16 раз, длина стебля и корня в 3 раза по сравнению с контролем, при внесении биопрепарата-нефтедеструктора на основе микробного удобрения Бамил масса стеблей увеличилась на 33%-53%, длина стебля и корня возросла в 4,5 раза по сравнению с нефтезагрязненной почвой.

Примечание:

1. Контроль – почва дерново-подзолистая.

2. Нефтезагрязненная почва (18% нефти).

3. В каждом варианте опыта оценено по 20 растений овса.

Пример 8 подтверждает, что биопрепарат-нефтедеструктор, полученный путем иммобилизации клеток бактерий (штамма Bacillus cereus 3 К) на микробное удобрение Бамил, обладает не только нефтедеструктирующей активностью, но способствует росту растений.

Приведенные примеры подтверждают, что биопрепарат-нефтедеструктор, полученный путем иммобилизации бактерий штамма Bacillus cereus 3 К на микробное удобрение Бамил, является перспективным биологическим препаратом, способным интенсифицировать микробные процессы в почве, и имеет нефтедеструктирующую активность почти в два раза выше, чем у ближайшего аналога.

Предложенный биопрепарат-нефтедеструктор на основе микробного удобрения Бамил использовался для обработки загрязненных нефтью почв в условиях Крайнего Севера и на аварийных разливах дизельного топлива Ленинградской области, наблюдения за динамикой процессов в нефтезагрязненной почве и оценка активизации восстановления почв при введении этого биопрепарата подтверждают его соответствие критерию «промышленная применимость».

Использование эффективного биопрепарата-нефтедеструктора для очистки нефтезагрязненных почв позволяет:

– повысить нефтедеструктирующую активность,

– стимулировать развитие нефтеокисляющей микрофлоры,

– увеличить скорость разложения нефти,

– обеспечить интенсификацию микробных процессов, восстанавливающую агрохимические свойства почвы,

– совместить положительные свойства минеральных и органических удобрений,

– стимулировать развитие и рост растений,

– проводить очистку нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом.

Формула изобретения

Биопрепарат-нефтедеструктор, включающий культуру бактерий и микробное удобрение-носитель в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержащее нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis, отличающийся тем, что в качестве культуры бактерий использован штамм Bacillus cereus 3 К с титром 10¹² клеток/г удобрения.

TK4A – Поправки к публикациям сведений об изобретениях в бюллетенях “Изобретения (заявки и патенты)” и “Изобретения. Полезные модели”

Напечатано: Адрес для переписки: 196608, Санкт-Петербург, Пушкин-8, ш.Подбельского, 3, Лаборатория микробной экотехнологии Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, И.А.Архипченко

Следует читать: Адрес для переписки: 169710, Республика Коми, г. Усинск, ул. Нефтяников, 31, ООО «ЛУКОЙЛ-Коми», В.Н.Зузлову

Номер и год публикации бюллетеня: 8-2008

Код раздела: FG4A

Извещение опубликовано: 27.04.2008 БИ: 12/2008