Патент на изобретение №2319479

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТАБЛЕТОК ПРЕПАРАТА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине. Предложен способ получения таблеток препарата альфа-фетопротеина, включающий смешивание со стабилизатором, добавление наполнителя, состоящего из микрокристаллической целлюлозы и картофельного крахмала или лактозы, покрытие полученной смеси оболочкой, состоящей из ацетилфталилцеллюлозы, при соотношении ингредиентов в вес.%: альфа-фетопротеин – 0,02-0,03, стабилизатор – 8,57-14,28, МКЦ – 40-45,7, крахмал картофельный или лактоза – 40-45,7 и АФЦ – 1,14-2,85. В качестве стабилизатора используют реополиглюкин, а альфа-фетопротеин получают из абортивной, пуповинной или плацентарной крови путем отделения балластных белков из крови центрифугированием, фракционирования супернатанта сульфатом аммония или сульфатом натрия, или этиловым спиртом в течение 1 ч, повторного центрифугирования раствора, проведения первой хроматографической очистки супернатанта на афинном сорбенте с использованием сефарозы CL-4B, элюирования альфа-фетопротеина 0,1 М глицин-HCl буферным раствором с рН 2,5 до достижения нулевых значений оптической плотности при длине волны 280 нм, затем второй хроматографиеской очистки на афинном сорбенте с использованием сефарозы CL-4B, содержащей иммобилизованные антитела против IgG человека, и диализа раствора альфа-фетопротеина относительно 0,15 моль/л раствора хлорида натрия. Целевой продукт разбавляют реополиглюкином до концентрации альфа-фетопротеина 0,9 мг/мл и декстрана 10 мг/мл. Изобретение обеспечивает увеличение выхода АФП и достижение максимальной чистоты целевого продукта, увеличение стабильности при хранении АФП, расширение области применения, создание препарата пролонгированного действия.

Способ предназначен для получения препарата альфа-фетопротеина (АФП) и может быть использован в фармацевтической промышленности и медицине. Изобретение касается способа получения таблетированной формы сывороточного белка АФП, включающего выделение АФП, его стабилизацию и смешивание с наполнителями, придание формы и покрытие оболочкой. АФП относится к группе иммуномодуляторов и может использоваться в качестве средства для лечения онкологических, аутоиммунных и аллергических заболеваний.

Последние эпидемиологические данные, опубликованные в ряде авторитетных научных изданий, свидетельствуют о том, что высокие уровни АФП у беременных женщин снижают у них последующий риск как пре-, так и постменопаузного рака груди и могут быть связаны со свойствами АФП в отношении подавления опухолевого роста. Было показано, что пониженный риск возникновения постменопаузного рака груди связан с высокими уровнями АФП в третьем триместре у женщин, у которых первая беременность была раньше 28 лет. Последующие исследования подтвердили и расширили данные предыдущей работы тем, что значения АФП в крови второго триместра у пременопаузных женщин до 38 лет также способствуют снижению риска развития злокачественных новообразований. Из этого вытекает, что высокие уровни АФП в сыворотке крови у матери во время любой беременности были связаны с низкой частотой заболевания раком груди; связь была особенно мощной при беременности в молодом детородящем возрасте. Эти результаты послужили толчком к предположению, что АФП и его вторичные пептиды могут использоваться не только в терапии рака, но также для предупреждения возможных других видов опухолей. Такой защитный эффект АФП во время беременности также наблюдался у женщин с многоплодной беременностью (двойня), дефектами невральных труб и предлежанием с преэклампсией. Все эти ситуации делят между собой общность повышенных уровней АФП в сыворотке, которые могут содержать достаточные количества конформационно индуцированных вариантов АФП для индукции супрессии роста микролокусов рака, присутствующих в тканях груди матери (Gerald J. Mizejewski, 2002).

АФП – представляет собой фетальный гликопротеин с молекулярной массой около 70000 Д. АФП в большом количестве продуцируются клетками печени и брюшной стенки плода. Сырьем для получения АФП служит абортивная, пуповинная и плацентарная кровь, получаемая при медицинских абортах от клинически здоровых женщин, прошедших стандартное обследование. Получаемый материал обязательно тестируется на отсутствие антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и на отсутствие вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С.

Применяют АФП преимущественно парентерально. Водные растворы АФП нестабильны в процессе хранения, поэтому задача получения высокостабильных лекарственных форм является актуальной. Наиболее эффективным способом стабилизации препаратов для целей длительного хранения является их лиофилизация с соответствующими добавками [5].

Онкофетальные белки получают из эмбриональной или опухолевой ткани человека или животных. Высокоочищенный АФП получают из абортивной крови методами аффинной хроматографии.

Известен способ получения АФП из опухолевой ткани человека, включающий выделение и хроматографическую очистку целевого продукта последовательно на нескольких сорбентах [2]. Его недостатком является высокая трудоемкость процесса и низкий выход целевого продукта.

Разработан способ получения АФП из эмбриональной ткани человека [1], включающий ее измельчение, помывку, обработку трипсином в течение 1 ч при температуре не более 37°С. Полученную суспензию клеток культивируют в питательной среде в течение 7-8 суток при 37°С, а целевой продукт отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Получают прозрачную жидкость оранжево-желтого цвета, содержащую 10% АФП.

Недостатками данного способа являются низкий выход и высокое содержание примесных белков.

Существует способ получения АФП из эмбриональной ткани человека [2], включающий обработку исходного материала бутиловым спиртом, центрифугирование, диализ водно-белковой фазы относительно 0,9%-ного раствора натрия хлорида, центрифугирование, инкубирование полученного супернатанта с эстрогеном в конечной концентрации 0,005% при температуре 0-10°С в течение 8 ч и выделение целевого продукта из супернатанта хроматографией на сефарозе CL-4B с иммобилизованным эстрогеном. Выход целевого продукта составляет 60-70%, а чистота препарата 90-95%.

Недостатками способа являются недостаточная чистота целевого продукта, наличие примеси альбумина и гемоглобина, а также высокая трудоемкость способа и необходимость работы с легковоспламеняющимся резко пахнущим органическим реактивом – бутиловым спиртом.

Одним из наиболее близких к изобретению является способ получения АФП из эмбриональной ткани человека 8-12 нед, полученной при медицинских абортах, включающий стадии [7]: измельчение и гомогенизация эмбриональной ткани; центрифугирование гомогената при 5000 об/мин; осветление супернатанта центрифугированием 12000 об/мин; очистка целевого продукта хроматографией на ДЕ-целлюлозе; очистка целевого продукта хроматографией на сефадексе G-100 с иммобилизованным на нем красителем цибакрон голубой F36-A; очистка целевого продукта рехроматографией на сефадексе G-100 с иммобилизованным на нем красителем цибакрон голубой F26-A; очистка целевого продукта хроматографией на ДЕ-целлюлозе.

Недостатками описанного способа являются длительность процедуры, низкий выход (25-30%) и недостаточная чистота (85-90%) целевого продукта, высокая трудоемкость и необходимость в сложном аппаратурном оснащении (высокоскоростные центрифуги).

Ближайшим аналогом является способ получения АФП [4]: абортивную кровь человека центрифугируют, полученный супернатант подвергают двустадийной хроматографической очистке (аффинная хроматография на Br-CN-сефарозе с иммобилизованными антителами к АФП и аффинная хроматография на Br-CN-сефарозе с иммобилизованным сбалансированным комплексом антител к белкам крови человека). Полученный раствор АФП обессоливают путем диализа против воды, стерилизуют и лиофилизируют.

Недостатками прототипа являются низкий выход (60-70%) и высокая контаминация примесными белками (чистота 90-95%) целевого продукта.

Определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа являются предварительная очистка исходной сыворотки крови путем фракционирования белков сыворотки спиртом этиловым или сульфатами аммония или натрия, нанесение на аффинный сорбент в присутствии натрия хлорида и тритона Х-100 для подавления неспецифической сорбции и инактивации вирусов и доочистка препарата до гомогенного состояния на втором иммуносорбенте, представляющем собой сефарозу, модифицированную антителами против IgG человека.

Известен способ получения таблеток АФП, заключающийся в том, что АФП выделяют из сыворотки крови, смешивают с альбумином, добавляют наполнители, состоящие из микрокристаллической целлюлозы и картофельного крахмала или лактозы, полученную смесь формируют в таблетки и покрывают оболочкой, состоящей из ацетилфталилцеллюлозы, при определенном соотношении ингредиентов (патент РФ №2154468, МПК А61К 9/20, А61Р 37/00 от 09.11.1999 г.).

Недостатками данного способа являются использование в качестве стабилизатора АФП альбумина человеческого, несущего дополнительную антигенную нагрузку при попадании в организм человека и неустойчивость при хранении в различных температурных режимах.

Технической задачей изобретения является увеличение выхода АФП и достижение максимальной чистоты, увеличение стабильности при хранении, расширение области применения, создание препарата пролонгированного действия.

Поставленная задача достигается следующим образом.

Проверенную на отсутствие вируса гепатита В, антител к ВИЧ, гепатиту С абортивную, пуповинную или плацентарную кровь очищают от примесных белков (в частности, иммуноглобулинов) путем фракционирования спиртом этиловым (5-30%) или сульфатом аммония или натрия (степень насыщения 30-40%), образовавшийся осадок центрифугируют и удаляют. Супернатант подвергают лиофилизации и/или диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,15 моль/л) и подвергают стерилизующей фильтрации через каскад фильтров с размером пор от 3,0 до 0,22 микрона. В разведенную стерильную сыворотку добавляют натрия хлорид (0,1-1,0 моль/л) и тритон Х-100 (0,01-0,5%) для блокирования неспецифической сорбции и инактивации вирусов. Подготовленную таким образом стерильную сыворотку наносят на сорбент с иммобилизованными антителами к АФП. Неспецифически сорбировавшиеся компоненты крови вымываются с сорбента последовательно 4-5 объемами 0,15 М фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,0-7,5, содержащего 0,5 М хлорода натрия, и таким же объемом раствора хлорида натрия (0,15 моль/л). Аффинно-связанный АФП элюируется глицин-HCl буферным раствором (0,05-0,15 моль/л).

Элюат нейтрализуется до рН 6,0-8,0 и наносится на сорбент с иммобилизованными антителами против IgG человека, где происходит аффинная сорбция человеческих иммуноглобулинов (негативная иммуносорбция), контаминирующих препарат после первой аффинной очистки. АФП, полученный после негативной иммуносорбции, разбавляется 0,9% раствором натрия хлорида и реополиглюкином до концентрации АФП 0,9 мг/мл и декстрана 10 мг/мл. После стерилизующей фильтрации субстанцию АФП смешивают с микрокристаллической целлюлозой (МКЦ), картофельным крахмалом или лактозой, формируют в таблетки, а затем покрывают оболочкой, состоящей из ацетилфталилцеллюлозы (АФЦ), при следующем соотношении ингредиентов, вес.%:

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Готовят сухую смесь в следующем соотношении:

АФП 0,02-0,03 вес.% 0,10-0,12 мг;

Реополиглюкин 8,57-14,28 вес.% 30-50 мг;

МКЦ 40,0-45,7 вес.% 140-160 мг;

крахмал картофельный или лактоза 40,0-45,7 вес.% 140-160 мг.

Механическое перемешивание осуществляют не менее 1 часа для достижения равномерного состава. Смесь смачивают ацетоном (ОСЧ) до тестообразного состояния. Таблетирование образовавшейся массы осуществляют при комнатной температуре под давлением. Полученные таблетки высушивают при температуре 37,0-37,5°С под вытяжкой. Влажность таблеток должна быть не более 7-8%. Высушенные таблетки погружают в раствор, содержащий около 5% АФЦ, и в течение 15 минут перемешивают. Затем жидкость отфильтровывают, а таблетки высушивают при температуре 37,0-37,5°С. Покрытые таблетки оболочкой из АФЦ (4-10 мг) нерастворимы при рН 1,0 в течение 2 часов, теряют оболочку и растворяются в течение 30 мин при рН 8,0, т.е. при рН в кишечнике человека.

Полученные таблетки имеют вес от 314,1 до 380,12 мг.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Все процедуры проводятся при +4°С. 3 л сыворотки крови центрифугируют со скоростью 3500 об/мин в течение 1 часа, осадок балластных веществ отбрасывают, а к 2,5 л супернатанта медленно прибавляют насыщенный раствор аммония сульфата до достижения 33% насыщения, инкубируют 1 час и центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 мин. 2 л супернатанта диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,5 моль/л), разбавляют раствором натрия хлорида (0,5 моль/л) до 8 л, добавляют тритон Х-100 до концентрации 0,01% и инкубируют с 1 л сефарозы CL-4B с иммобилизованными антителами к АФП. Инкубацию осуществляют в течение 48 ч при постоянном перемешивании.

Неспецифически сорбировавшиеся компоненты крови вымывают с сорбента последовательно 4-5 объемами фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 0,5 М натрия хлорида, и таким же количеством 0,15 М раствора натрия хлорида.

После отмывки сорбента раствором натрия хлорида (0,15 моль/л) проводят элюирование 0,1 М глицин-HCl буферным раствором с рН 2,5. Процесс элюирования контролируют по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюирование проводится до достижения нулевых значений оптической плотности. Элюат, содержащий целевой продукт, нейтрализуют до рН 6,5-7,5 и наносят на колонку с сефарозой CL-4B с иммобилизованными антителами против IgG человека.

Полученный препарат, содержащий АФП, очищенный от глобулинов, альбумина и других примесных белков, диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,15 моль/л), разбавляют реополиглюкином до концентрации АФП 0,9 мг/мл и декстрана 10 мг/мл.

После стерилизующей фильтрации раствор АФП разливают во флаконы и хранят при +4°С до момента проведения дальнейших технологических этапов. Электрофоретическая чистота полученого препарата анализируется методом электрофореза в градиенте полиакриламидного геля. Чистота полученного АФП более 98%. Выход АФП составляет 75%. Полученный АФП тестируется на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С. Препарат стерилен, не содержит пирогенных и токсических примесей.

Далее для приготовления таблеток берут 0,10 мг АФП, 30 мг реополиглюкина, 140 мг МКЦ и 140 мг крахмала картофельного, перемешивают в течение 1 часа до достижения равномерного состава. Смесь смачивают ацетоном (ОСЧ) до тестообразного состояния. Из образовавшейся массы делают таблетки под давлением при комнатной температуре, высушивают их при t 37,0-37,5°С под вытяжкой до достижения влажности таблеток 7-8%. Высушенные таблетки погружают в раствор, содержащий около 5% АФЦ, перемешивают в течение 15 минут, отфильтровывают жидкость, таблетки сушат при t 37,0-37,5°С.

Пример 2.

Все процедуры проводятся при +4°С. 3 л сыворотки крови центрифугируют со скоростью 2500 об/мин в течение 1 ч, осадок балластных веществ отбрасывают, а к 2,5 л супернатанта медленно прибавляют насыщенный раствор аммония сульфата до достижения 33% насыщения, инкубируют 1 ч и центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 мин. 2 л супернатанта диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,5 моль/л), разбавляют раствором натрия хлорида (0,5 моль/л) до 8 л, добавляют тритон Х-100 до концентрации 0,01% и наносят на хроматографическую колонку, заполненную 1 л сефарозы 4B-CL с иммобилизованными антителами к АФП. Скорость нанесения 320 мл/ч. Нанесение осуществляется трехкратным прохождением наносимого объема через колонку.

Неспецифически сорбировавшиеся компоненты крови вымываются с сорбента последовательно фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0,5 М натрия хлорида, и 0,15 М раствором натрия хлорида со скоростью 300 мл/ч до достижения нулевых значений оптической плотности.

После отмывки сорбента раствором натрия хлорида (0,15 моль/л) проводят элюирование 0,1 М глицин-HCl буферным раствором с рН 2,5 и скоростью 150 мл/ч. Процесс элюирования контролируют по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюирование проводится до достижения нулевых значений оптической плотности. Элюат, содержащий целевой продукт, нейтрализуют до рН 6,5-7,5 и наносят на хроматографическую колонку с сефарозой CL-4B с иммобилизованными антителами к IgG человека. Скорость нанесения 80 мл/ч.

Весь прошедший через колонку раствор, содержащий АФП, очищенный от глобулинов, альбумина и других примесных белков, диализуют относительно раствора натрия хлорида (0,15 моль/л) и разбавляют реополиглюкином до концентрации АФП 0,9 мг/мл и декстрана 10 мг/мл.

После стерилизующей фильтрации раствор АФП разливают во флаконы и хранят при +4°С для проведения дальнейших технологических этапов. Электрофоретическую чистоту полученного препарата АФП проверяют методом электрофореза в градиенте полиакриламидного геля. Чистота полученного АФП более 98%. Выход АФП составляет 75%. Полученный препарат тестируется на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С. Препарат стерилен, не содержит пирогенных и токсических примесей.

Далее способ приготовления осуществляют аналогично примеру 1, но вместо крахмала картофельного берут лактозу в том же количестве.

Состав таблеток следующий, мг:

Пример 3.

Способ осуществляют аналогично примерам 1 и 2, но состав таблеток следующий, мг:

Использование предлагаемого способа имеет своей целью существенно повысить чистоту целевого продукта за счет предварительного фракционирования белков исходной сыворотки крови и двойной аффинной хроматографии на сорбентах высокой специфичности; увеличить выход АФП с аффинного сорбента с иммобилизованными антителами к АФП благодаря применению глицин-HCl буферного раствора; сократить время полного технологического цикла за счет отсутствия стадии гель-фильтрации; получить удобную в применении, пролонгированного действия лекарственную форму АФП; использовать таблетки АФП не только с лечебной (иммуномодулятор и противоопухолевое действие), но и с профилактической целью (профилактика опухолеобразования).

Источники информации

1. А.с. №403407, кл³ А61К 35/48. “Способ получения биостимулятора”. Заявл. 26.11.68. Опубл. 26.10.73.

2. А.с. 1497806 СССР, МКИ⁴ А61К 37/02. 48. “Способ получения альфа-фетопротеина”.

3. А.с. 2100031. «Способ получения альфа-фетопротеина». / В.В.Стариков, С.Ю.Родионов, Мягкоходов В.А., Пак Н.А. (Россия). – №95120418/113. Заявл. 01.12.95. Опубл. 27.12.97. Бюл. №36.

4. А.с. 2121350, А61К 31/715. «Способ получения препарата альфа-фетопротеина». / В.В.Стариков, С.Ю.Родионов, Мягкоходов В.А., Решетников С.С., Пак Н.А. (Россия). – №96111118/14. Заявл. 01.12.95. Опубл. 27.12.97. Бюл. №36.

5. Никитин В.В., Звягин И.В. «Замораживание и высушивание биологических препаратов». М.: Колос, 1971, 344 с.

6. Gold Phil et all. “Physicochemical Approach to the Purification of Human Fetoprotein from the Ascites Fluid of a Hepatoma-bearning” Patient. Cancer research. 1978, – №36, – p.6-12.

7. Huse Klaus et all “A novel purification procedure for human fetoproteun by application of immobilized Cibacron Blu F36-A as affinity ligand Clinica ChimicaActa” 133, 1983, 335-340.

Формула изобретения

Способ получения таблеток альфа-фетопротеина, включающий смешивание со стабилизатором, добавление наполнителя, состоящего из микрокристаллической целлюлозы и картофельного крахмала или лактозы, покрытие полученной смеси оболочкой, состоящей из ацетилфталилцеллюлозы при соотношении ингредиентов, вес.%: альфа-фетопротеин – 0,02-0,03, стабилизатор – 8,57-14,28, МКЦ – 40-45,7, крахмал картофельный или лактоза – 40-45,7 и АФЦ – 1,14-2,85, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора используют реополиглюкин, а альфа-фетопротеин получают из абортивной, пуповинной или плацентарной крови, отделяют балластные белки из крови центрифугированием, проводят фракционирование супернатанта сульфатом аммония, или сульфатом натрия, или этиловым спиртом в течение 1 ч, повторно центрифугируют раствор при 2500 об./мин 30 мин, полученный супернатант разбавляют 0,1-1,0 моль/л раствором хлорида натрия и 0,01-0,5%-ным раствором тритона Х-100, осуществляют первую хроматографическую очистку супернатанта на афинном сорбенте с использованием сефарозы CL-4B, элюируют альфа-фетопротеин 0,1 М глицин-HCl буферным раствором с рН 2,5 до достижения нулевых значений оптической плотности при длине волны 280 нм, затем осуществляют вторую хроматографическую очистку на афинном сорбенте с использованием сефарозы CL-4B, содержащей иммобилизованные антитела против IgG человека, диализуют раствор альфа-фетопротеина относительно 0,15 моль/л раствора хлорида натрия, после чего целевой продукт разбавляют реополиглюкином до концентрации альфа-фетопротеина 0,9 мг/мл и декстрана 10 мг/мл.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 15.11.2007

Извещение опубликовано: 10.02.2009 БИ: 04/2009

NF4A – Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 20.02.2009

Извещение опубликовано: 20.02.2009 БИ: 05/2009

RH4A – Выдача дубликата патента Российской Федерации на изобретение

Дата выдачи дубликата: 05.05.2010

Наименование лица, которому выдан дубликат:

ООО Научный центр “Профеталь” (RU)

Извещение опубликовано: 20.06.2010 БИ: 17/2010

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 15.11.2009

Извещение опубликовано: 27.09.2010 БИ: 27/2010