Патент на изобретение №2319142

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2,4,6-ТРИНИТРОМЕТИЛБЕНЗОЛА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способам определения 2,4,6-тринитрометилбензола в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций и химико-токсикологических лабораторий. Анализируемую пробу измельчают, дважды настаивают с ацетонитрилом (каждый раз в течение 45 минут), извлечения отделяют от твердых частиц биоматериала, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 16-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей гексан – ацетон (8,5:1,5), хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 с использованием подвижной фазы гексан – ацетон (8,5:1,5), фракции элюата, содержащие 2,4,6-тринитрометилбензол, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в системе растворителей ацетонитрил – вода (4:6) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом «Nova Pack С-18», используя подвижную фазу ацетонитрил – вода (4:6) и диодно-матричный детектор при температуре колонки 20°С и скорости подачи подвижной фазы 1 мл/мин. Достигается повышение точности и чувствительности, а также – ускорение анализа. 3 табл.

Изобретение относится к биологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способам определения 2,4,6-тринитрометилбензола в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций и химико-токсикологических лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения органических веществ в биологическом материале путем измельчения исследуемого биологического объекта, неоднократного настаивания с этанолом (каждый раз в течение суток), объединения вытяжек, сгущения объединенного извлечения, осаждения в нем белков абсолютным этанолом, фильтрования, упаривания фильтрата до густоты сиропа и разбавления его водой с последующей экстракцией анализируемых соединений сначала из кислого, а затем из щелочного раствора (Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. – М.: Медицина, 1975. – С.119-123).

Способ трудоемок, требует значительных затрат времени на его осуществление, характеризуется низкой степенью извлечения 2,4,6-тринитрометилбензола и малой селективностью.

Известен способ определения 2,4,6-тринитрометилбензола в биологическом материале, заключающийся в неоднократном настаивании биологического объекта с диэтиловым эфиром при возможном добавлении к биологическому объекту безводного сульфата натрия, отделении эфирных извлечений, их объединении, испарении эфира, растворении остатка в ацетоне с последующей обработкой этанольным раствором гидроксида натрия и измерением оптической плотности образующегося окрашенного раствора (Гадаскина И.Д., Филов В.А. Превращения и определение промышленных органических ядов в организме. – Л.: Медицина, 1971. – С.254-255).

Способ характеризуется низкой чувствительностью, недостаточно высокими селективностью и точностью определения.

Наиболее близким является способ определения 2,4,6-тринитрометилбензола в биологическом материале путем измельчения биологического объекта, настаивания с равным по массе количеством 95% этанола в течение 24 часов, прибавления к смеси дистиллированной воды до получения раствора с содержанием этанола 15%, фильтрования смеси, неоднократной экстракции эфиром, объединения экстрактов, испарения части объединенного эфирного извлечения до сухого остатка, растворения остатка в ацетоне с последующим определением анализируемого вещества методом газожидкостной хроматографии в колонке длиной 122 см, заполненной сорбентом OV-17 на хромосорбе W, с использованием азотно-фосфорного детектора и гелия в качестве подвижной фазы при скорости подачи гелия 40 мл/мин, воздуха 280 мл/мин, водорода 2 мл/мин, температуре детектора 270°С, инжектора 230°С, колонки 185°С.

Задачей настоящего изобретения является сокращение продолжительности анализа, повышение точности и чувствительности определения, увеличение степени извлечения анализируемого вещества из биологического материала.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) измельчают, двукратно обрабатывают ацетонитрилом (каждый раз в течение 45 минут), ацетонитрильные извлечения объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 16-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей гексан – ацетон (8,5:1,5), хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 (минимальный и максимальный размер частиц сорбента) с использованием подвижной фазы гексан – ацетон (8,5:1,5), фракции элюата, содержащие 2,4,6-тринитрометилбензол, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в системе растворителей ацетонитрил – вода (4:6) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом «Nova Pack C-18» (насадка в виде двуокиси кремния, обработанной C₁₈, с размером пор 60 А° и содержанием углерода 7%), используя подвижную фазу ацетонитрил – вода (4:6) и диодно-матричный детектор при температуре колонки 20°С и скорости подачи подвижной фазы 1 мл/мин.

Способ осуществляется следующим образом: биологическую ткань, содержащую 2,4,6-тринитрометилбензол, измельчают, дважды настаивают с ацетонитрилом (каждый раз в течение 45 минут), извлечения отделяют от твердых частиц биоматериала, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 16-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в ацетоне, полученный раствор вводят в сорбент, растворитель испаряют, хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 с использованием подвижной фазы гексан – ацетон (8,5:1,5), фракции элюата, содержащие 2,4,6-тринитрометилбензол, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в системе растворителей ацетонитрил – вода (4:6) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом «Nova Pack C-18», используя подвижную фазу ацетонитрил – вода (4:6) и диодно-матричный детектор при температуре колонки 20°С и скорости подачи подвижной фазы 1 мл/мин.

Пример 1

Качественное определение 2,4,6-тринитрометилбензола в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной свежей трупной ткани печени человека прибавляют 10 мг 2,4,6-тринитрометилбензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом, оставляют на 2 часа при температуре 16-18°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 г ацетонитрила, выдерживают 45 минут, периодически перемешивая.

Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Вытяжки объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 16-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в 10 мл ацетона. 1 мл полученного раствора смешивают с 1 г силикагеля L 40/100 и испаряют остатки ацетона из сорбента в токе воздуха.

В колонку размером 490×10 мм вносят вначале 9 г силикагеля типа L 40/100, а затем, поверх образующегося слоя, – 1 г силикагеля L 40/100, содержащего анализируемое вещество, предварительно введенное в виде ацетонового раствора. Хроматографирование осуществляют, используя в качестве элюента систему растворителей гексан – ацетон (8,5:1,5). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 6 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22°С. Остаток растворяют в 50 мл смеси растворителей ацетонитрил – вода (4:6). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф «Alliance» фирмы «Waters» (США), снабженный диодно-матричным детектором. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной сорбентом с привитой поверхностью «Nova Pack C-18», используя подвижную фазу ацетонитрил – вода (4:6). Скорость подачи подвижной фазы составляет 1 мл/мин, температура колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 229 нм. Качественное определение 2,4,6-тринитрометилбензола осуществляют по величинам характерных значений объема и времени удерживания, которые равны соответственно 7650 мкл и 7,65 мин.

Пример 2

Количественное определение 2,4,6-тринитрометилбензола в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной свежей трупной ткани печени человека прибавляют 10 мг 2,4,6-тринитрометилбензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 2 часа при температуре 16-18°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 г ацетонитрила, выдерживают 45 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Вытяжки объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 16-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в 10 мл ацетона. 1 мл полученного раствора смешивают с 1 г силикагеля L 40/100 и испаряют остатки ацетона из сорбента в токе воздуха. В колонку размером 490х10 мм вносят вначале 9 г силикагеля L 40/100, а затем, поверх образующегося слоя сорбента, – 1 г силикагеля L 40/100, содержащего анализируемое вещество, предварительно введенное в виде ацетонового раствора. Хроматографирование осуществляют, используя в качестве элюента систему растворителей гексан – ацетон (8,5:1,5). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 6 включительно объединяют, испаряют в токе воздуха при температуре 16-22°С. Остаток растворяют в 50 мл смеси растворителей ацетонитрил – вода (4:6). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф «Alliance» фирмы «Waters» (США), снабженный диодно-матричным детектором. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной сорбентом с привитой поверхностью «Nova Pack С-18», используя в качестве подвижной фазы систему растворителей ацетонитрил – вода (4:6). Скорость подачи подвижной фазы составляет 1 мл/мин, температура колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 229 нм.

Пик на хроматограмме со временем удерживания 7,65 мин (объемом удерживания 7650 мкл) соответствует 2,4,6-тринитрометилбензолу.

Количественное содержание 2,4,6-тринитрометилбензола определяют, исходя из площади хроматографического пика, и пересчитывают на навеску данного вещества, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 50 мл вносят 1,25, 2,54, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 мл 0,0025% раствора, 5,0, 10,0, 20,0 мл 0,02% раствора 2,4,6-тринитрометилбензола в ацетонитриле, соответственно 18,75, 17,5, 15,0, 10,0, 5,0, 0,0, 15,0, 10,0, 0,0 мл ацетонитрила и доводят объем раствора в каждой колбе до метки водой. 8 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм с сорбентом «Nova Pack C-18», используя в качестве элюента систему растворителей ацетонитрил – вода (4:6). Скорость подачи подвижной фазы составляет 1 мл/мин, температура колонки 20°С.Оптическую плотность регистрируют при длине волны 229 нм. По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 5·10^-9-6,4·10^-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=4938107·C-1575,55,

где S – площадь хроматографического пика;

С – концентрация определяемого вещества в анализируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения 2,4,6-тринитрометилбензола в ткани печени представлены в таблице 1.

Пример 3

Количественное определение 2,4,6-тринитрометилбензола в ткани легких

К 10 г мелкоизмельченной свежей трупной ткани легких человека прибавляют 10 мг 2,4,6-тринитрометилбензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 2 часа при температуре 16-18°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 г ацетонитрила, выдерживают 45 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Вытяжки объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в 10 мл ацетона. 1 мл полученного раствора смешивают с 1 г силикагеля L 40/100 и испаряют остатки ацетона из сорбента в токе воздуха. В колонку размером 490×10 мм вносят вначале 9 г силикагеля L 40/100, а затем, поверх образовавшегося слоя сорбента,- 1 г силикагеля L 40/100, содержащего анализируемое вещество, предварительно введенное в виде ацетонового раствора. Хроматографирование осуществляют, используя в качестве элюента систему растворителей ацетонитрил – вода (4:6). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 6 включительно объединяют, испаряют в токе воздуха при температуре 16-22°С. Остаток растворяют в 50 мл смеси растворителей ацетонитрил – вода (4:6). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф «Alliance» фирмы «Waters» (США), снабженный диодно-матричным детектором. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной сорбентом с привитой поверхностью «Nova Pack С-18», используя в качестве подвижной фазы систему растворителей ацетонитрил – вода (4:6). Скорость подачи подвижной фазы составляет 1 мл/мин, температура колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 229 нм.

Пик на хроматограмме со временем удерживания 7,65 мин (объемом удерживания 7650 мкл) соответствует 2,4,6-тринитрометилбензолу.

Количественное содержание 2,4,6-тринитрометилбензола определяют, исходя из площади хроматографического пика, и пересчитывают на навеску данного вещества, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика

Процесс построения калибровочного графика и его уравнение приведены выше в примере 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 16 раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 2 раза в ткани печени, в 1,5 раза увеличивает степень извлечения 2,4,6-тринитрометилбензола из ткани печени (с 61,41% до 90,38%), снижает продолжительность одного анализа в 8 раз (с 25-26 часов до 3,5 часов), характеризуется более высокой точностью (относительная ошибка среднего результата уменьшается в 2 раза).

Таблица 1
Результаты определения 2,4,6-тринитрометилбензола в ткани печени
№	Внесено 2,4,6-тринитрометилбензола, мг в 10 г печени	Найдено			Метрологические характеристики
		мг		%
1.	10,00	9,368		93,68	=90,38
2.	10,00	9,143		91,43	S=2,27
3.	10,00	8,810		88,10	=1,02
4.	10,00	8,856		88,56	=2,84
5.	10,00	9,012		90,12
Таблица 2
Результаты определения 2,4,6-тринитрометилбензола в ткани легких
№	Внесено 2,4,6-тринитрометилбензола, мг в 10 г легких	Найдено			Метрологические характеристики
		мг	%
1.	10,00	9,426	94,26		=93,75
2.	10,00	9,139	91,39		S=1,95
3.	10,00	9,264	92,64		=0,87
4.	10,00	9,385	93,85		=2,42
5.	10,00	9,659	96,59

Формула изобретения

Способ определения 2,4,6,-тринитрометилбензола в биологическом материале путем измельчения пробы, обработки органическим растворителем, отделения извлечения и последующего хроматографирования, отличающийся тем, что биологическую ткань обрабатывают ацетонитрилом двукратно – каждый раз в течение 45 мин, ацетонитрильные извлечения объединяют, упаривают при температуре воздуха 16-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-ацетон 8,5:1,5, хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 с использованием подвижной фазы гексан-ацетон 8,5:1,5, фракции элюата, содержащие 2,4,6-тринитрометилбензол, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в системе растворителей ацетонитрил-вода 4:6 и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом «Nova Pack С-18», используя подвижную фазу ацетонитрил-вода (4:6) и диодно-матричный детектор при температуре колонки 20°С и скорости подачи подвижной фазы 1 мл/мин.