Патент на изобретение №2318871

(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ГКВ 2389 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ И ИНАКТИВИРОВАННОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Вакцинный штамм А/17/утка/Потсдам/86/93 (H5N2), депонированный в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского под №2389 – реассортант, полученный путем апатогенного птичьего вируса А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2) с холодоадаптированным температурочувствительным штаммом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Штамм активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 33°С, характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью, унаследовал от донора аттенуации H5N2 ген, кодирующий поверхностный гликопротеин гемагглютинин, шесть генов, кодирующих негликозилированные белки и ген нейраминидазы. Штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) безвреден для животных и способен создавать защиту против высокопатогенных вирусов H5N1, обладающих пандемическим потенциалом. 8 табл.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики гриппа с помощью интраназальной живой и парентеральной инактивированной гриппозной вакцины из штамма вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus A А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2).

Широкое распространение в странах Юго-Восточной Азии высокопатогенных вирусов гриппа подтипа A (H5N1) привело, начиная с декабря 2003 г., более, чем к 100 случаям заболевания людей, более половины из которых скончались. В последнее время высокопатогенные вирусы гриппа подтипа А (Н5N1) были выделены на территории России и ряда стран СНГ. Подобное обширное распространение вирусов H5N1 создает угрозу возникновения пандемической ситуации и вызывает необходимость разработки срочных противопандемических мер, что отражено в приказе Минздрава РФ о создании Координационного совета по подготовке к пандемии гриппа [Приказ №40 от 28.12.2004]. Применяемые в настоящее время для профилактики эпидемического гриппа А вакцины подтипов H1N1 и H3N2 не могут вызывать выраженную защитную реакцию в случае широкомасштабной вспышки, вызванной вирусами подтипа H5N1, к которым у подавляющего большинства населения нет иммунитета.

Задачей, на решение которой направлено заявленное изобретение, является получение вакцинного штамма новой антигенной разновидности на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2М2) – обозначение «Лен/17» – с использованием в качестве источника поверхностных антигенов апатогенного вируса гриппа птиц А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2) – обозначение «Н5N2-дт». Штамм А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2), выделенный в 1986 г. в Потсдаме от домашних уток в процессе текущего надзора за гриппом, был получен из коллекции Центра по контролю и предупреждению заболеваний США. Секвенирование гена гемагглютинина (НА) показало, что структура сайта протеолитического расщепления НА не содержит вставки из основных аминокислотных остатков, что характерно для апатогенных вирусов гриппа птиц.

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2) – холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1986. – С.66-83]. Применяемые в настоящее время вакцинные штаммы для живых гриппозных вакцин (ЖГВ) получают методом реассортации современных эпидемических вирусов с холодоадаптированными (ХА) донорскими штаммами, в результате чего образуются реассортанты, имеющие смешанный геном. Гены, кодирующие гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального эпидемического штамма, а шесть генов внутренних и неструктурных белков (РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS) – от безвредного ХА донора аттенуации. Известен вакцинный штамм А/17/Новая Каледония/99/145 (Н1N1) [Патент №2183672, опубл. 20.06.02], а также вакцинный штамм А/17/Панама/99/242 (Н3N2) [Патент №2248935, опубл. 20.03.05] на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2).

В отношении создания вакцинного штамма, содержащего поверхностные антигены вируса гриппа птиц подтипа H5N2 была выбрана стратегия, аналогичная получению реассортантных штаммов на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2) с современными эпидемическими вирусами H1N1 и H3N2. Реассортантный штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) – обозначение «Лен17/Н5» – был получен методом классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) апатогенного птичьего вируса А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2) с ХА штаммом А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2). Метод классической генетической реассортации включает коинфицирование РКЭ смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, после чего полученный вируссодержащий материал пассируется 3-4 раза при пониженной до 25°С в присутствии антисыворотки к донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2), после чего проводится клонирование методом конечных разведении [Г.И.Александрова. Вопр. Вирусол. – 1977. – №4. – С.387-395]. Полученные клоны подвергаются детальному анализу. Анализ генома одного из полученных реассортантов (А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) был выполнен с помощью ПЦР-рестрикционного анализа [Klimov A.I., Сох N.J. J. Virol. Method. – 1995. – №55. – Р.445-44] и частичным или полным секвенированием ДНК-копий отдельных генов. Полученные с помощью ОТ-ПЦР ДНК-копии сегментов РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS и NA обрабатывали соответственно эндонуклеазами рестрикции Tru9I, HindIII, BamHI, AsnI, EcoRI, PvuI, NciI, SphI соответственно. Дополнительно копии сегментов РВ1, PA и M были обработаны рестриктазами BstXI, AsnI BciVI. Было показано, что сайты рестрикции в положениях нуклеотидной цепи, характерные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2), присутствуют в генах ВР2 (1459), PA (107 и 1045), NP(1066), M(68 и 969), NA(78). В то же время утрачены сайты рестрикции в генах РВ1(819 и 975) и NS(798), что также характерно для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2). Таким образом показано, что реассортант унаследовал ген NA и 6 генов негликозилированных белков от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА РЕАССОРТАНТНОГО ШТАММА А/17/УТКА/ПОТСДАМ/86/92 (Н5N2).

Принадлежность НА реассортанта родительскому штамму «дикого» типа А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2) подтверждена в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с набором иммунных антисывороток. РТГА проводили в 96-луночных планшетах для иммунологических реакций, в которые последовательно вносили последовательные падающие разведения иммунных антисывороток с шагом 2, соответствующие антигены в стандартной дозе (4 агглютинирующих единицы) и 0,75% взвесь эритроцитов индюка. Титр антигемагглютинирующих антител выражали как величину, обратную наибольшему разведению сыворотки, при котором наблюдалось торможение агглютинации.

Показано, что вакцинный кандидат А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) антигенно идентичен родительскому штамму А/утка/Потсдам/1402-6/86(Н5N2) (Таблица 1) [Desheva et al., Options for the control of Influenza V. – Ed. Y. Kawaoka, Elsevier. – 2004. – P. 724-727].

ТЕМПЕРАТУРОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И ХОЛОДОВАЯ АДАПТАЦИЯ.

Для определения инфекционной активности делали ряд падающих десятикратных разведений исследуемого вирусного материала, зараженные РКЭ инкубировали при оптимальной (34°С), пониженной до 25°С или повышенной до 40°С температуре. К числу температурочувствительных (имеющих ts фенотип) относили вирусы, которые репродуцировались при повышенной температуре по сравнению с оптимальной с разностью в 5,0-6,0 Ig ЭИД₅₀ и более. Если разница титров при оптимальной и пониженной до 25°С температуре не превышала 3,0-3,5 Ig EID₅₀ вирусы относили к ХА группе. Было показано, что штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) является температурочувствительным (разность титров при 33°С и 40°С – 6,8 Ig ЭИД₅₀/мл) и холодоадаптированным (разность титров при 33°С и 25°С – 3,1 Ig ЭИД₅₀/мл) (Таблица 2).

Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму – структурой генома, необходимой для реассортантных вакцинных штаммов, антигенной специфичностью гемагглютинина вируса «дикого» типа А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2), температурочувствительностью, холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией, характерной для ХА донорского штамма и соответствует требованиям Фармакопейной статьи [ФСП 42-0417409703 на вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную сухую. – 2003. – 12 с.].

Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского под №2389.

Морфология штамма – полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО ШТАММА

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33°С в течение 48 часов – 9,3 Ig ЭИД₅₀/мл.

Гемагглютинирующая активность – 1:512.

Штамм проявляет генетическую стабильность после пассажа в носовых ходах хорька. Реассортантный вирус А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) вводили в носовые ходы хорька в дозе 7,2 Ig ЭИД₅₀ с последующим выделением реизолятов на 3-й и 6-й день после инокуляции. Носовые смывы пассировали трехкратно в РКЭ. Вакцинный вирус, выделенный на 3-й день после инокуляции, сохранил все кодирующие мутации в генах внутренних и неструктурных белков, характерные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2) (Табл.3). На 6-й день после инокуляции вирус не был выделен.

Вирулентность: авирулентен.

Штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) безвреден при введении курам и белым мышам.

Пример 1. ПРОВЕРКА БЕЗВРЕДНОСТИ КАНДИДАТА В ВАКЦИННЫЕ ШТАММЫ НА КУРАХ.

При определении патогенности на курах, внутривенное введение 0,2 мл вакцинного вируса было безвредным, не наблюдалось симптомов заболеваемости ни в одном случае из 8. При интраназальном введении 0,5 мл вакцинного вируса также не наблюдалось симптомов заболеваемости, вирус не был выделен из носоглоточных и клоакальных смывов и не вызывал сероконверсий ни в одном случае из пяти (Табл. 4). Таким образом, реассортант А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) продемонстрировал высокую степень аттенуации для кур, что подтверждает безопасность при производстве и использовании вакцины на его основе.

Пример 2. ПРОВЕРКА БЕЗВРЕДНОСТИ ШТАММА – КАНДИДАТА В ВАКЦИННЫЕ ШТАММЫ НА МЫШАХ.

Безвредность штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) изучена на мышах линии BALB/c при интраназальном введении 50 мкл аллантоисной жидкости, содержащей 10⁶ 50% эмбриональной инфекционной дозы (ЕИД₅₀) вируса. Концентрацию вирусов определяли в легких и носовых ходах мышей на 3-и сутки по показателям титрования суспензии органов в развивающихся куриных эмбрионах начиная с разведения 1:10 для легких и 1:2 для носовых ходов. 50% мышиную инфекционную дозу (МИД₅₀) 50% летальную дозу (LD₅₀) определяли по методу Reed-Muench. Результаты выражали как значение ЭИД₅₀, соответствующее 1 МИД₅₀ или 1 LD₅₀ Реассортант был аттенуированным для мышей, репродуцируясь более эффективно в носовых ходах (3,5 Ig ЕИД₅₀/мл), чем в легочной ткани (1,6 Ig ЕИД₅₀/мл) (Табл.5).

Штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) иммуногенен и эффективен против последующего заражения высокопатогенными вирусами подтипа H5N1 при интраназальном введении мышам.

ОЦЕНКА ИММУНОГЕННОСТИ И ЗАЩИТНЫХ СВОЙСТВ.

Оценка гуморального иммунного ответа в сыворотках подопытных животных проводилась через 28 дней после введения препаратов в иммуноферментном анализе (ИФА) по описанной методике [Rowe Т., et al. J. of Clinical microbiology. – 1999. – Vol.37. – Р.937-943]. 96-луночные панели для ИФА покрывали 100 ГАЕ/0,1 мл цельного очищенного инактивированного формалином вируса А/Гонконг/213/03 (Н5N1) (Гонконг/213) или очищенным рекомбинантным НА вируса А/Гонконг/483/97 (Н5N1) (Гонконг/483) в концентрации 4 мкг/мл. Результаты выражали в десятичных логарифмах величины, обратной конечному разведению. За конечное разведение принимали наивысшее разведение образца, дающее оптическую плотность при длине волны 490 нм, превышающую среднюю оптическую плотность в контрольных образцах более чем на 3 стандартных отклонения.

В ИФА выявлено наличие в сыворотках мышей, иммунизированных реассортантом А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2), специфических IgG и IgA к вирусам подтипа H5N1: к цельному вирусу Гонконг/213 и очищенному рекомбинантному НА вируса Гонконг/483 (Табл.6).

Для заражения животных (по 5 животных в группе) через 2 месяца после первичной иммунизации использовали вирусы подтипа H5N1: Гонконг/483 или Гонконг/213. Мышей, иммунизированных 10⁶ ЭИД₅₀ каждого из исследуемых вирусов, инфицировали 10 LD₅₀ вируса Гонконг/483. Летальность и снижение веса регистрировали в течение 14 дней. Животных, иммунизированных 10⁷ ЭИД₅₀, заражали 100 МИД₅₀ вируса Гонконг/213. Концентрацию вируса в легких определяли на 3-й день после заражения по результатам титрования суспензии легких на РКЭ.

Мыши, иммунизированные однократно с помощью ЖГВ из штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2) в дозе 300 50% мышиных инфекционных доз (МИД₅₀), были защищены на 100% от летальной инфекции вирусом Гонконг/483 в дозе 50 LD₅₀, в то время как в контрольной группе наблюдалась 100% смертность животных. Однократная интраназальная иммунизация ЖГВ вызывала 100% защиту против последующей инфекции 100 МИД₅₀ вируса Гонконг/213, заражающий вирус не был выделен из легких ни в одном случае из пяти (Табл. 7).

Таблица 7. Резистентность мышей, иммунизированных реассортантным вирусом А/17/утка/Потсдам/86-92 (Н5N2) к заражению вирусами подтипа H5N1.

Препарат	Заражение 10 LD50		Заражение 100 МИД50 А/Гонконг/213/2003
	Летальность	Максимальная потеря в весе (%)	Средние титры выделения вируса из легочной ткани (Ig EID50/ml)
Лен17/Н5	0/8	5	1.5
Н5N2-дт	0/8	0	1.5
Контроль	8/8	23	4.9

Таким образом, было показано, что ЖГВ из реассортантного вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2), содержащего НА апатогенного птичьего вируса подтипа H5N2, была безвредной, иммуногенной и эффективной при однократном введении против последующей инфекции высокопатогенными вирусами подтипа H5N1, в том числе и значительно отличавшимися по антигенным свойствам.

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ НА МЫШАХ ПРИВИВОЧНЫХ СВОЙСТВ ЖГВ И ИГВ ИЗ ШТАММА А/17/УТКА/ПОТСДАМ/86/92 (Н5N2).

Изучение на мышах прививочных свойств цельновирионной вакцины из штамма Лен17/Н5 с добавлением гидроокиси алюминия и без нее показало, что однократное применение вакцины без адьюванта было недостаточно эффективным против последующей инфекции высокопатогенным вирусом H5N1, выделенным в 2005 г. во Вьетнаме [Lu X., Edwards L.E., Desheva J.A., et al. Vaccine. – 2006. – Vol.24 (44-46). – P 6588-6593]. Для достижения 100% защиты от инфекции требовалось двукратное введение вакцины с адьювантом (Табл.8)

Таблица 8. Эффективность против заражения антигенным вариантом вируса H5N1, выделенным во время вспышки во Вьетнаме в 2004 г.
Препарат	Путь введения	Кратность введения	Титр нейтрализующих антител к вирусу А/Вьетнам/1203/04	Средние титры вируса Ig ЭИД50/мл			Снижение веса (%)	Летальность / всего
				Легкие	Носовые ходы	Головной мозг
ЖГВ	интраназально	1	<40	1.6±1.2	0,8	0,8	7,3	0/5
ИГВ	внутримышечно	1	<40	2,8±1,8	1,0±0,4	1,1±0,7	11,2	0/5
ИГВ	внутримышечно	2	<40	0,8	0,8	0,8	8,0	0/5
ИГВ+адьювант	внутримышечно	2	<40	0,8	0,8	0,8	1,8	0/5
Контроль	интраназально	1	<40	6,1±0,7	4,7±0,9	4,5±0,1	19,4	5/5

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма – А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2).

2. Серия – серия 1.

3. Метод получения – реассортация; характеристика родительских вирусов:

а) эпидемический вирус – А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2);

б) донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2).

4. Количество пассажей – 7 в процессе рекомбинации.

5. Характеристика штамма до лиофилизации:

а) оптимальные условия репродукции – 33°, 48 часов;

б) гемагглютинирующая активность 1:512;

в) инфекционная активность 8,5±0,3 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл;

г) чувствительность к ингибиторам: ингибиторорезистентный;

д) разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 40°С – 6,8 Ig ЭИД₅₀/мл;

е) разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 25°С – 3,1 Ig ЭИД₅₀/мл;

ж) структура генома реассортанта:

– гены от апатогенного птичьего вируса – НА

– гены от донора аттенуации – PA, PB1, РВ2, NP, M, NS, NA

6. Характеристика штамма после лиофилизации:

а) дата лиофилизации: 24.11.2005 г.;

б) объем материала во флаконе: 1 мл;

в) количество доз в серии: 4;

г) инфекционная активность – 7.5 Ig ЭИД₅₀/0.2 мл;

д) гемагглютинирующая активность – 1:256.

7. Рекомендуемое разведение при вакцинации 1:2.

8. Антигенная специфичность:

а) гемагглютинина – идентичен вирусу А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2) по данным РТГА с крысиной антисывороткой;

б) нейраминидазы – идентична вирусу А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2) по данным секвенирования.

9. Безвредность для мышей при подкожном и интраназальном введении – безвреден.

10. Бактериологический контроль лиофилизированного материала: дата проведения – 30 ноября 2005 г. – стерилен.

11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов – посторонние вирусы отсутствуют.

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа ГКВ 2389 для получения живой интраназальной и инактивированной парентеральной гриппозной вакцины.