Патент на изобретение №2317996

(54) N’-{N-[3-ОКСО-ЛУПАН-28-ОИЛ]-9-АМИНОНОНАНОИЛ}-3-АМИНО-3-ФЕНИЛ-ПРОПИОНОВАЯ КИСЛОТА И ЕЕ СОЛИ КАК ПРОТИВОВИРУСНЫЕ И ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ АГЕНТЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к новым химическим соединениям, конкретно к N’-{N-[3-оксо-лупан-28-оил]-9-аминононаноил}-3-амино-3-фенил-пропионовой кислоте и ее солям, формула I, обладающим противовирусной (анти-ВИЧ) и иммуностимулирующей активностью. Соединения формулы I нетоксичны, получаются с высоким выходом из доступного сырья – бетулина, выделяемого из березовой коры. 4 табл.

Изобретение относится к новым химическим соединениям, конкретно к N’-{N-[3-оксо-лупан-28-оил]-9-аминононаноил}-3-амино-3-фенил-пропионовой кислоте и ее солям формулы I, обладающим противовирусной (анти-ВИЧ) и иммуностимулирующей активностью.

Сочетание противовирусной и иммуностимулирующей активности делают данные вещества перспективными для использования в медицине как основы противовирусных препаратов.

Производные тритерпенов лупанового ряда в последнее время активно исследуются в качестве противовирусных (анти-ВИЧ) агентов. Описан синтез целого ряда производных бетулиновой (3-гидрокси-лупен-20(29)-28-овой) кислоты. В частности, синтезированы 3-О-ацилаты, среди которых выделяются диметилсукцинаты 2, 3, дипептиды, например, 4, а также бифункциональные производные, например, соединение 5. [Cichewicz R.H., Kouzi S.A., Med. Res. Rev., 2004, V.24, N 1,90; Huang L., Ho Ph., Lee K.-H., Chen Ch.-H, Bioorg. Med. Chem., 2006, 14, 2279].

Подходом, который может расширить ассортимент агентов, перспективных для разработки анти-ВИЧ препаратов, является использование в качестве исходного соединения бетулоновой (3-оксо-лупен-20(29)-28-овой) кислоты 6. Это вещество синтезируется проще, чем бетулиновая (3-гидрокси-лупен-20(29)-28-овая) кислота 7, поскольку является промежуточным продуктом в схеме синтеза бетулиновой кислоты из бетулина 8. Последний получается экстракцией коры березы с выходом до 25% [Krasutsky P.A., Nat. Prod. Rep., 2006].

Противовирусная активность бетулоновой кислоты и ее производных изучена в малой степени. Известно, что дипептид бетулоновой кислоты, имеющий структуру N’-{N-[3-оксо-лупен-20(29)-28-оил]-9-аминононаноил}-3-амино-3-фенилпропионовой кислоты 9, обладает иммуностимулирующей и противовирусной активностью [Пат. РФ. №2211843, БИ №25, 2003].

Это соединение, описанное ранее нами, взято в качестве ближайшего прототипа настоящей заявки.

Задачей предлагаемого изобретения является расширение перечня высокоактивных противовирусных агентов и получение соединений, обладающих повышенной анти-ВИЧ активностью по сравнению с аналогами. Поставленная задача достигается новыми химическими соединениями, полученными на основе дигидробетулоновой (3-оксо-лупан-28-овой) кислоты 10, в частности N’-{N-[3-оксо-лупан-28-оил]-9-аминононаноил}-3-амино-3-фенил-пропионовой кислоты 1, и ее солями, обладающими высокой противовирусной активностью и иммуностимулирующим действием.

Синтез заявляемых соединений 1 осуществляли следующим образом: бетулин 8 (или суммарный продукт экстракции коры березы, содержащий 85-90% бетулина и 8-10% лупеола 14) подвергали каталитическому гидрированию, приводящему к дигидробетулину 15 (или к его смеси с дигидролупеолом 16). Затем следует окисление, например, хромовой кислотой, дающее дигидробетулоновую кислоту 10 либо ее смесь с лупанолом 18. Выделение и очистка кислоты 10 ведется через соль. Вторым полезным продуктом (в случае использования природной смеси тритерпенов) является лупанон 17.

Обработка дигидробетулоновой кислоты 10 хлористым оксалилом дает хлорангидрид кислоты 11, конденсацией которого с 9-аминононановой кислотой получали амид 12. Взаимодействие полученного амида 12 с метиловым эфиром 3-фенил-3-аминопропионовой кислоты приводит к образованию метилового эфира дипептида 13, гидролизом которого получают целевой продукт I.

Соли аммония, лития, натрия, калия и кальция Ia-Iд получали нейтрализацией дипептида I соответствующими гидратами окисей.

Анти-ВИЧ активность дипептида 1 оценивали по двум схемам, отличающимся порядком внесения образца в суспензию клеток: а) после адсорбции вируса; б) одновременно с вирусом.

Препаратом сравнения служил азидотимидин (АЗТ) и ранее описанный дипептид 9. Как видно из табл.1, дипептид 1 не только активно ингибирует ВИЧ-1, но и защищает клетки от вирус-индуцированного цитопатического действия. Согласно данным табл.2. при одновременном внесении с вирусом дипептид 1 обеспечивает 50% ингибирование репродукции вируса при концентрации 0,0012 мкМ с индексом селективности 5667. Важной характеристикой противовирусной активности служит сравнение концентраций, вызывающих 50 и 90% ингибирование накопления вируса. Из данных табл.2 следует, что концентрация заявляемого дипептида 1, приводящая к 90% ингибированию вируса, составляет 0,10 мкМ, что существенно ниже соответствующей концентрации АЗТ и описанного ранее дипептида 9.

Заявляемый дипептид 1 эффективно защищает клетки от вирус-индуцированного цитопатического действия (PD₅₀=0,0012 мкМ; IS=5667)

По сравнению со структурным аналогом, в качестве которого взято соединение 4, показавшего ID₅₀ в культуре клеток МТ-4 в отношении разных штаммов ВИЧ-1 в пределах 0,045-0,75 мкМ (Y.Kashiwada, Hashimoto F., Cosentino L.M., Chen C.-H., Garrett P.E., Lee K.-H., J. Med. Chem., 1996, V, 39, 1016), индекс селективности (IS) заявленного дипептида] существенно выше. Кроме того, заявляемый дипептид 1 превосходит по этим показателям непредельный аналог 9.

Несомненным достоинством изобретения является возможность применения заявляемого соединений 1 в качестве перорального средства, что определяется низкими значениями ингибирующих концентраций.

Иммуностимулирующее действие заявленного дипептида 1 определяли в опытах на белых беспородных мышах массой 18-20 г. Влияние на стимуляцию Т-клеточного иммунитета при введении сильного антигена эритроцитов барана (ЭБ) исследовали методом розеток. Препаратами сравнения были взяты неполный адъювант Фрейнда (НАФ) и глицирризиновая кислота (ГК) – известный иммуностимулятор. Из табл.3 следует, что дипептид 1 стимулирует образование розеток при индексе стимуляции, соответствующем таковому для ГК.

Влияние дипептида 1 на стимуляцию В-клеточного ответа определяли по увеличению титра специфических антител после иммунизации бычьим сывороточным антигеном (БСА). Препаратом сравнения служила гидроокись алюминия, используемая в вакцинах в качестве адъюванта. Как видно из данных табл.4, при иммунизации слабым антигеном (БСА) дипептид 1 обнаружил выраженную иммуностимулирующую активность: титр специфических антител увеличился в два раза по сравнению с контролем, что более чем на порядок выше эффекта ГК.

Для дипептида 1 определена острая токсичность на белых беспородных мышах обоего пола. LD₅₀ заявляемого дипептида 1 составила более 2500 мг/кг, что соответствует 3 классу умеренно опасных веществ.

Таким образом, новое соединение – дипептид 1, имеющий строение N’-{N-[3-оксо-лупан-28-оил]-9-аминононаноил}-3-амино-3-фенил-пропионовой кислоты, является нетоксичным, обладает противовирусной (анти-ВИЧ) активностью и иммуностимулирующим действием.

Заявляемое соединение – дипептид 1 – получается с высоким выходом из доступного отечественного сырья – бетулина, получаемого экстракцией березовой коры (бересты), являющейся крупнотоннажным отходом деревообрабатывающей промышленности и не находящим в настоящее время широкого квалифицированного использования.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Получение 3-оксо-лупан-28-овой (дигидробетулоновой) кислоты 10 из природной смеси тритерпенов.

Смесь тритерпеноидов, полученных экстракцией коры березы повислой (Betula pendula L), содержащая 85-90% бетулина и 8-10% лупеола, в количестве 50 г суспендировали в 1 л этанола, помещали в автоклав и после внесения скелетного никеля, полученного выщелачиванием 20 г 40% сплава Ni-Al, проводили гидрирование при 100°С и давлении 100 атм.

Смесь выгружали, нагревали до кипения и отфильтровывали осадок катализатора. Раствор упаривали в вакууме досуха. Кристаллический остаток, содержащий дигидробетулин 15 и лупанол 16, использовали далее без дополнительной очистки.

К 10 г суспензии тритерпенов после гидрирования в 300 мл ацетона добавляли в течение 30 мин 25 мл реактива Джонса (135 г CrO₃, 100 мл конц. H₂SO₄, вода до 1 л). перемешивали 5 часов при 0°С, добавляли изопропанол до устойчивой зеленой окраски раствора и выливали в 1,5 л воды со льдом, к которой добавляли конц. HCl до рН 2. Осадок отсасывали, промывали подкисленной (HCl) водой, затем водой, высушивали и растворяли при нагревании в толуоле или метил-трет.-бутиловом эфире (МТБЭ).

Раствор фильтровали горячим и к охлажденному фильтрату приливали 5% раствор NaOH до рН водного слоя 11. После перемешивания в течение получаса смесь оставляли стоять на 1 час, фильтровали натриевую соль дигидробетулоновой кислоты промывали толуолом (МТБЭ) и высушивали. Органический слой упаривали досуха, остаток лупанона кристаллизовали из смеси метанол-CHCl₃., выход 0,6-0,8 г, т.пл. 208-210°С.

Натриевую соль растворяли при нагревании в водном спирте, раствор фильтровали горячим и выливали в избыток 5% HCl. Осадок дигидробетулоновой кислоты, выпавший при стоянии, отсасывали и высушивали, выход 6,0-6,5 г, т.пл. 250-252°С

ПРИМЕР 2. Синтез дигидробетулоновой кислоты (10) из бетулина. Бетулин (10 г), 300 мл этанола загружали в автоклав, вносили 1 г 10% палладия на угле и гидрировали при 100°С и 100 атм водорода. Дигидробетулин 15, выделенный обычным образом из реакционной смеси, суспендировали в 400 мл ацетона и добавляли в течение 30 мин 26 мл реактива Джонса в 100 мл ацетона, после чего перемешивали при 0°С 7 часов. К смеси приливали спирт до перехода желтой окраски раствора в зеленую, затем выливали в 1,5 л холодной воды и сильно подкисляли HCl. Осадок сырой дигидробетулоновой кислоты отсасывали, промывали водой и высушивали. Для очистки растворяли при нагревании в толуоле или МТБЭ, фильтровали горячим и к охлажденному фильтрату приливали 5% раствор КОН для образования соли (водный слой должен иметь рН 11). Соль отфильтровывали, промывали толуолом или МТБЭ и сушили в вакууме. Калиевую соль растворяли при нагревании в спирте, нерастворимую часть отфильтровывали, фильтрат выливали в избыток разбавленной HCl. Осадок дигидробетулоновой кислоты промывали и кристаллизовали из спирта. т.пл. 253-254°С.

ПРИМЕР 3. Синтез N’-{N-[3-оксо-лупан-28-оил-]9-аминононаноил}-3-амино-3-фенил-пропионовой кислоты 1.

А) К раствору 5,0 г дигидробетулоновой кислоты 10 в 200 мл безводного хлористого метилена приливали 2,0 мл хлористого оксалила, перемешивали при 20°С 5-6 часов и упаривали досуха в вакууме при t<35°С. К остатку приливали 50 мл сухого хлористого метилена и упаривали досуха. После троекратного повторения этой операции получено 4,8 г хлорангидрида дигидробетулоновой кислоты 11.

В ИК-спектре продукта имеются полосы с частотами 1705 см^-1 и 1802 см^-1, характерные для 3-оксогруппы и группировки COCl.

Б) Раствор (1,05 мм) гидрохлорида аминононановой кислоты. 1,5 мл (10 мм) перегнанного триметилхлорсилана в 150 мл безводного хлористого метилена кипятили 4 часа в атмосфере аргона, охлаждали до 0°С, добавляли 2,0 г (4,5 мм) хлорангидрида (11) и 1,05 мл перегнанного триэтиламина и выдерживали 24 часа при перемешивании и 20°С. К смеси приливали 100 мл хлористого метилена, промывали 10% HCl, затем водой и 5% NaHCO₃, снова водой и после высушивания раствора Na₂SO₄ упаривали досуха. Остаток хроматографировали на силикагеле и элюировали смесью CHCl₃-CH₃CN=95:5.

Получено 2,1 г N-(3-оксолупан-28-оил)-9-аминононановой кислоты 12, т.пл. 100-102°С.

Масс-спектрометрически найдено:

мол. масса 611, C₃₉H₆₅NO₄

Вычислено: 611.

В спектре ПМР отсутствуют сигналы винильных протонов при 4,57 и 4,67 m.g.

В) К раствору 1,21 г (2 мм) амида 12 в 150 мл безводного хлористого метилена в инертной атмосфере при 0°С добавляли 0,29 г 1-гидроксибензотриазола и 5,1 г N,N-дициклогексилкарбодиимида и перемешивали полчаса при 0°С и 5 часов при 20°С.

К охлажденной до 0°С смеси добавляли 0,55 г гидрохлорида метилового эфира 3-амино-3-фенилпропионовой кислоты и 0,38 мл приэтиламина, после чего перемешивали сутки при 20°С.

Выпавший после охлаждения смеси до 0°С осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали и промывали холодным хлористым метиленом. Объединенные фильтраты промывали 10% HCl, водой, 5% NaHCO₃, водой и выпаривали досуха. Остаток хроматограф ировали на Al₂O₃ с элюированием хлороформом. Получено 1,3-1,4 г метилового эфира дипептида 13, который растворяли в 25 мл смеси метанол-тетрагидрофуран 1:2 и после добавления 2 мл 4М раствора NaOH выдерживали сутки при 20°С. Смесь выливали на смесь льда с разбавленной HCl, осадок отфильтровывали, промывали водой и сушили под Р₂О₅.

Получено 1,2 г дипептида 1, т.пл. 140-143°С; []_D+10,5°

Масс-спектрометрически найдено: Мм 758. C₄₈H₇₄N₂O₅

Вычислено: 758.

В спектре ПМР отсутствуют сигналы винильных протонов при 4,57 и 4,67 m.g.

В ИК-спектре нет полосы при 1650 см^-1, характерной для изопропилиденовой групп.

ПРИМЕР 4. Получение солей дипептида 1

К раствору дипептида 1 в необходимом объеме метанола или этанола приливали эквивалентное количество NH₄OH, LiOH, NaOH, КОН или Са(ОН)₂ в растворе метанола.

После упаривания досуха и выдерживания в вакууме получали соответствующие соли с количественным выходом.

Аммонийная соль: бесцветный порошок, С₄₇Н₇₃N₂O₄CO₂NH₄

Литиевая соль: бесцветный порошок, C₄₇H₇₃N₂O₄CO₂Li

Натриевая соль: кремовый порошок, С₄₇Н₇₃N₂O₄CO₂Na

Калиевая соль: желтоватый порошок, С₄₇Н₇₃N₂O₄CO₂K.

Кальциевая соль: бесцветный порошок С₄₇Н₇₃N₂O₄CO₂Ca_1/2

ПРИМЕР 5. Оценка цитотоксичности дипептида 1 на клетках МТ-4

Цитотоксичность соединения 1. оценивали на культуре клеток перевиваемых Т-лимфоцитов человека (линия МТ-4). Навеску агента (I) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентрации 10 мг/мл и готовили последовательные разведения в ростовой среде, затем вносили аликвоты соответствующих разведении в лунки 96-луночных планшетов (по три на каждое разведение) при рассеве клеток до конечных концентраций от 0,1 до 100 мкг/мл. Посевная концентрация составляла 0,5×10⁶ клеток/мл. Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) клетки культивировали в 96-луночных планшетах для культур клеток фирмы “Costar” (США) на ростовой питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы фирмы “ICN” (США), 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина, и 5% CO₂ в течение 4 суток при 37°С. По окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего. Строили дозозависимую кривую, из которой определяли цитотоксическую дозу (CD₅₀) концентрацию соединения, на 50% снижающую долю жизнеспособных клеток по сравнению с контролем. CD₅₀ для соединения 1 составляет 5,6 мкМ (табл.1).

ПРИМЕР 6. Оценка анти-ВИЧ активности дипептида 1 при внесении препарата после адсорбции вируса.

⁶ клеток/мл и вносили в лунки 96-луночного культурального планшета. Затем вносили в лунки аликвоты последовательных разведении дипептида 1 в ДМСО до конечных концентраций от 0,1 нг/мл до 1 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию). Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) клетки инфицированные клетки (без препарата культивировали при 37°С и 5% CO₂₅₀) – концентрацию дипептида I, на 50% снижающую накопление вирусного антигена р24 по сравнению с контролем, которая для дипептида 1 составляет 0,4 мкМ. Терапевтический индекс селективности (IS), рассчитываемый как отношение цитотоксической дозы к эффективной (CD₅₀/ID₅₀), составляет для дипептида 1, IS 34. Количественные данные ингибирования репродукции вируса представлены в табл.2.

ПРИМЕР 7. Оценка анти-ВИЧ активности дипептида 1 при внесении препарата одновременно с вирусом.

Анти-ВИЧ-1 активность дипептида 1 изучали на высокочувствительной к ВИЧ культуре клеток МТ-4.

Клетки МТ-4 вносили лунки 96-луночного культурального планшета заражали стоком вируса (штамм ВИЧ-1/ЭВК) с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку, затем вносили исследуемое вещество в суспензию клеток одновременно с вирусом до конечной концентрации 0,00001 до 1 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и инкубировали при 37°С в течение 1 ч (адсорбция вируса). По окончании инкубации суспензию инфицированных клеток разводили полной ростовой средой со всеми добавками, как описано выше, содержащей препараты в тех же концентрациях. До посевной концентрации 0,5×10⁶ клеток/мл.

Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) клетки, инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивировали при 37°С и 5% СО₂₅₀) – концентрацию дипептида 1, на 50% снижающую накопление вирусного антигена р24 по сравнению с контролем, которая для дипептида 1, составляет 0,0012 мкМ. Терапевтический индекс или индекс селективности (IS), рассчитываемый как отношение цитотоксической дозы к эффективной (CD₅₀/ID₅₀), составляет для дипептида 1 5667.

Кроме того, определяли ID₉₀ – концентрацию дипептида 1, подавляющую продукцию вируса на 90%, которая для изучаемого соединения составляет 0,10 мкМ, а также PD₅₀₅₀ (CD₅₀/PD₅₀), составляет 460.

Количественные данные ингибирования репродукции вируса представлены в табл.2

Пример 8. Влияние дипептида 1 на Т-клеточный иммунитет при иммунизации сильным антигеном.

В работе использовали нелинейных мышей-самцов массой 20-22 г. Животным вводили подкожно взвесь ЭБ (10⁷ клеток на мышь) с 200 мкг (10 мг/кг) исследуемого дипептида 1 в 0,5 мл физиологического раствора. Контрольным животным вводили ЭБ без дипептида 1, (отрицательный контроль) или ЭБ с НАФ (положительный контроль); еще одна контрольная группа – неиммунные мыши. На 6 день после иммунизации готовили суспензию спленоцитов с концентрацией 10 живых клеток в 1 миллилитре. 0,9 мл суспензии спленоцитов и 0,1 мл суспензии эритроцитов (10⁹ клеток в миллилитре) помещали в пенфлаконы, перемешивали и инкубировали 16 ч при 4°С. После инкубации в пенфлаконы вносили по 4 мл холодной среды, осторожно перемешивали; пипеткой с широким носиком отбирали 100 мкл суспензии клеток, окрашивали 0,4%-ным раствором трипанового синего и считали количество розеток в камере Горяева [Фримель X. Иммунологические методы / Пер. с нем., под ред. М.А.Фроловой. – М.: Мир. 1979, 518 с]. Результаты представляют как число розеток на 10 клеток. Индекс стимуляции рассчитывали как соотношение числа розеток в эксперименте (иммунизация ЭБ в смеси с исследуемым соединением) и числа розеток в контроле (иммунизация только ЭБ).

Данные представлены в табл.3.

Пример 9. Влияние дипептида 1 на В-клеточный иммунитет при иммунизации слабым антигеном.

Животным вводили подкожно 400 мкг БСА в 0,5 мл 0,9% NaCl. Дипептид 1 вводили подкожно в дозе 200 мк/кг. В работе использовали 3 группы контрольных животных. Одну группу иммунизировали БСА с НПФ (1:1 по объему), вторую – БСА с 1%-ным Al(ОН)₃

Формула изобретения

N’-{N[3-оксо-лупан-28-оил]-9-аминононаноил}-3-амино-3-фенил-пропионовая кислота и ее соли формулы (1)

обладающие противовирусной (анти-ВИЧ) и иммуностимулирующей активностью.