Патент на изобретение №2317704

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО КАЧЕСТВУ МОЛОКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных. Генетический потенциал КРС оценивают путем ДНК-тестирования (ПЦР-ПДРФ метод) генотипов животных по RsaI-маркеру гена пролактина и AluI-маркеру гена гормона роста и выявлении сопряженных генотипов по локусам пролактина и гормона роста, определяющих повышенное или пониженное содержание жира и белка в молоке, согласно разработанному перечню генотипов. Способ позволяет проводить ранний отбор перспективных телок для молочного животноводства и принимать решение о целесообразности использования быков-производителей до появления у них лактирующего потомства, а также осуществлять подбор пар в селекционной работе по улучшению молочных пород. 6 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”italian Holstein-Friesian bulls, J Dairy Sci, 1996 Aug, 79(8), p.1446-53. YAO J et al, Sequence variations in the bovine growth hormone gene characterized by single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis and their association with milk production traits in Holsteins, Genetics, 1996 Dec, 144(4), p.1809-16.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к способу определения генетического потенциала крупного рогатого скота (КРС) по содержанию (в %) жира и белка в молоке с целью раннего отбора телок для молочного животноводства и решения вопроса о целесообразности использования быков-производителей до появления у них лактирующего потомства, а также для подбора пар в селекционной работе по улучшению молочных пород.

Известен способ отбора телок с желательным содержанием белка и жира в молоке будущих лактации по родословным, общему развитию и экстерьеру, отбора быков-производителей – по показателям молочной продуктивности дочерей. Однако эти традиционные методы отбора животных малоэффективны, связаны с большими временными затратами и материальными издержками.

Развитие молекулярно-генетических методов анализа, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволило разработать новые маркерные системы, обеспечивающие определение генотипов животных непосредственно на уровне генетического материала клетки (на уровне ДНК) независимо от пола и возраста, сократить время анализа и повысить его точность.

^th

Более перспективны способы оценки генетического потенциала коров по показателям молочной продуктивности, учитывающие совместное влияние двух или нескольких генов, участвующих в формировании признака молочной продуктивности.

В качестве прототипа выбран способ определения животных с улучшенными показателями молочной продуктивности на основе анализа полиморфизма генов транскрипционного фактора Pit-1 и каппа-казеина. Выявлены генотипы, обеспечивающие повышенный уровень удойности, содержания жира и белка в молоке, по отдельным локусам: генотипы ТТ и АА по гену Pit-1 и генотип ВВ по гену каппа-казеина, а также сопряженные генотипы по двум локусам: ТТВВ и ААВВ [WO 2003076657, 18.09.2003 Renaville, Robert et al. Method for identifying animals for milk production qualities by analysing the polymorphism of the Pit-1 and kappa-casein genes]. Однако в патенте не представлены данные по продуктивности групп животных с гетерозиготными генотипами, не приведены абсолютные значения параметров продуктивности для групп животных с гомозиготными генотипами (данные представлены только в виде относительных величин, как разница в продуктивности между группами гомозиготных животных). В патенте не даны также оценки достоверности различий между показателями молочной продуктивности у животных с хозяйственно-ценными гомозиготными генотипами и остальными группами животных. Все вышеперечисленное не позволяет оценить диагностическую ценность предложенной маркерной системы. Кроме того, маркерные гены (каппа-казеин и транскрипционный фактор гормона роста Р/М) не относятся к одной метаболической цепи, что не исключает случайный характер выявленной авторами взаимосвязи этих генов и ставит под сомнение обоснованность рассмотрения их генотипов как сопряженных.

Задача изобретения – создание эффективного способа определения генетического потенциала по параметрам молочной продуктивности КРС (содержание жира и белка) для раннего выявления перспективных животных в молочном животноводстве и племенной работе, значительно сокращающего временные и экономические затраты.

Сущность изобретения – способ определения генетического потенциала КРС по уровню содержания жира и белка в молоке с использованием тест-системы, основанной на RsaI-изменчивости экзона III гена гормона роста и AluI-изменчивости экзона V гена пролактина, и выявлении сопряженных генотипов, ассоциированных с указанными параметрами молочной продуктивности. Использование в предлагаемом способе генов пролактина и гормона роста, участвующих в одной метаболической системе, а именно в формировании молочной продуктивности, более адекватно по сравнению с прототипом отражает существующие ассоциации с параметрами молочной продуктивности КРС.

RsaI-рестрикционный полиморфизм в экзоне III гена пролактина (bPRL) обусловлен молчащей A-G транзицией, возникающей в 103 кодоне аминокислоты и приводящей к появлению полиморфного RsaI-сайта. Рестрикционный AluI-полиморфизм в экзоне V гена гормона роста (bGH) обусловлен трансверсией C-G, что приводит к аминокислотной замене в позиции 127 (2141 нуклеотидная позиция) аминокислоты лейцин на аминокислоту валин (Leu на Val, кодон CTG на кодон GTG) в белковом продукте и исчезновению AluI-сайта (AG|CT) в нуклеотидной последовательности гена. Аминокислота лейцин соответствует AluI(+) (аллель L), а валин – AluI(-) (аллель V).

Способ основан на ПЦР с последующим рестрикционным анализом продуктов амплификации (метод ПЦР-ПДРФ) и включает в себя выделение ДНК, амплификацию фрагмента экзона III гена пролактина и фрагмента экзона V гена гормона роста с использованием специфичных праймеров, рестрикционный анализ полученных ампликонов RsaI- и AluI-эндонуклеазами, соответственно, установление генотипов по каждому гену с последующим выявлением сопряженных генотипов по обоим генам. Полученные сопряженные генотипы сравнивают с перечнем установленных генотипов, обуславливающих повышенное (или пониженное) содержание жира и белка в молоке (табл.1).

Способ осуществляют следующим образом.

1. Выделяют ДНК из образцов крови (200 мкл) животного с применением набора реагентов DIAtom^TM DNA Prep (фирма “Биоком”, Москва) или любым другим стандартным методом. Возможно использование других тканей или клеток животного (луковицы волос, сперма и др.).

Размер полученных фрагментов определяют методом электрофореза в 2% агарозном геле.

3. Проводят рестрикцию амплифицированного фрагмента экзона III гена bPRL эндонуклеазой рестрикции RsaI, а фрагмента гена bGH – рестриктазой AluI в стандартных условиях.

4. Размер полученных рестрикционных фрагментов определяют методом электрофореза в 6%-ном полиакриламидном геле.

5. Определяют генотипы по каждому гену (согласно табл.2) и затем сопряженные генотипы по обоим генам, возможные варианты которых приведены в табл.3.

6. Сравнивают выявленные у животных сопряженные генотипы с генотипами, определяющими повышенное или пониженное содержание жира и белка в молоке (согласно табл.1).

7. Принимают решение о целесообразности использования животного с данным сопряженным генотипом в молочном производстве и селекционной работе.

Пример 1. Данным способом был проведен анализ коров Ярославской породы (113 особей из хозяйств “Михайловское” и “Горшиха” Ярославской области). Определены генотипы животных по отдельным локусам (пролактина и гормона роста) и сопряженные генотипы по обоим локусам.

Методом двухфакторного дисперсионного анализа оценено влияние генов пролактина (RsaI-маркер) и гормона роста (AluI-маркер), а также их совместное влияние (RsaI*AluI) на параметры молочной продуктивности ярославского скота (табл.4).

Значение уровня достоверности указывает на наличие или отсутствие влияния исследуемых факторов (в данном случае генотипов по отдельным локусам и сопряженных генотипов) на параметры молочной продуктивности. Достоверные значения (выделены в табл.4 жирным шрифтом) получены при оценке влияния на содержание белка и жира в молоке только для сопряженных генотипов. По генотипам отдельно рассматриваемых генов достоверной зависимости не выявлено. Не было выявлено также влияния генотипов по отдельным исследуемым локусам и их сопряженным генотипам на удойность ярославского скота. В связи с этим в дальнейших расчетах рассматривалось только влияние определенных сопряженных генотипов на содержание (в %) белка и жира в молоке коров.

Сравнительный анализ параметров молочной продуктивности исследованных животных с различными сопряженными генотипами показал достоверные различия по содержанию жира (%) в молоке между животными с генотипами 1 и 2 (см. табл.5) и группой животных с генотипами 3 и 4, а по содержанию белка (%) – между животными с сопряженными генотипами, обозначенными в таблице цифрами 1*, 2*, З* и группой генотипов 4*, 5*, 6*. На основе полученных результатов были установлены группы генотипов с повышенными и пониженными показателями исследованных признаков, достоверно отличающиеся друг от друга (табл.5).

В табл.6 приведены средние значения содержания жира (%) и белка (%) в молоке крупного рогатого скота и их стандартные ошибки для названных групп генотипов.

Таким образом, выявлены сопряженные генотипы по локусам генов пролактина и гормона роста, определяющие повышенное и пониженное содержание жира и белка в молоке крупного рогатого скота. Использование предложенного способа позволяет на ранних этапах жизни животных оценивать их потенциал по признакам молочной продуктивности (жир и белок), что значительно ускоряет отбор животных при формировании высокопродуктивного молочного стада, а также повышает эффективность селекционной работы по улучшению молочных пород.

Формула изобретения

Способ определения генетического потенциала крупного рогатого скота по качеству молока, включающий выделение ДНК, амплификацию с использованием специфичных праймеров, рестрикционный анализ полученных ампликонов с установлением генотипов отдельно по каждому гену, а затем сопряженных генотипов по обоим генам, которые сравнивают с установленными генотипами, определяющими качество молока, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют праймеры, специфичные для фрагмента экзона III гена пролактина и фрагмента экзона V гена гормона роста, анализ полученных ампликонов проводят RsaI- и AluI-рестриктазами соответственно, а в качестве установленных генотипов, обуславливающих повышенное содержание жира и белка в молоке, используют генотипы abVV, bbVL и aaVV, abLL, bbLL соответственно, а генотипов, обуславливающих пониженное содержание жира и белка в молоке, – генотипы abLL, bbVV и aaLL, abVV, bbVV соответственно.