Патент на изобретение №2317100

(54) СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ БЕЛКОВЫХ ПЛЕНОК НА ТВЕРДЫХ ПОДЛОЖКАХ

(57) Реферат:

Изобретение относится к таким областям как биохимия, биофизика, медицинская диагностика и может быть использовано в качестве модели клеточной мембраны при исследовании механизма действия лекарственных мембранопротекторных препаратов, а также для создания активных элементов биосенсорных устройств. Сущность способа нанесения белковых пленок на твердую подложку основана на использовании в качестве иммобилизующего слоя для белковых молекул смешанного сложного эфира целлюлозы – ацетопивалината целлюлозы, который повышает степень упорядоченности молекул белка, увеличивает плотность заполнения белковой пленки и обеспечивает экономическую эффективность предлагаемого способа. 5 ил.

Изобретение относится к таким областям как биохимия, биофизика, медицинская диагностика и может быть использовано в качестве модели клеточной мембраны при исследовании механизма действия лекарственных мембранопротекторных препаратов, а также для создания активных элементов биосенсорных устройств.

Приведенные примеры демонстрируют многолетние усилия, предпринятые для создания упорядоченных белковых пленок с целью использования их в биосенсорах и элементах биоэлектроники. Процесс связывания белка сильно зависит от природы последнего. На сегодняшний день универсального и надежного метода для создания упорядоченных белковых моно- и мультислоев не разработано. Получаемые белковые пленки приближенно передают электрофизические и геометрические свойства отдельных элементов биомембранных структур, хотя моделирование химических и структурных свойств биомембран позволяет изучать отдельные свойства этих сложных систем.

I – монослой фосфолипида, II – белковые молекулы, III – монослой фосфолипида (фиг.1).

Данный способ формирования белкового слоя может быть принят за прототип.

Получение белкового слоя щелочной фосфатазы по указанному способу, когда в качестве иммобилизующего агента применен традиционно используемый тип липида – дипальмитоилфосфатидилхолин, показало, что распределение белка и липида на твердой подложке может быть дефектным и неоднородным, что является его недостатком из-за неустойчивой воспроизводимости, что видно на фиг.2. Неоднородность состава поверхности в этом случае может быть связана с тем, что природа контактирующей поверхности белка способна изменять характеристики упаковки липидного слоя. Кроме того, использование природных липидных компонентов ограничено рядом факторов: эти соединения являются дорогостоящими; хранятся на холоде и после разгерметизации быстро окисляются на воздухе, что затрудняет их хранение и ухудшает иммобилизирующие свойства липидного монослоя.

Целью данного технического решения является улучшение однородности белоксодержащей пленки за счет повышения степени заполнения, упорядоченности и прочности белковой пленки, а также удешевление способа получения образцов. Поставленная цель достигается тем, что в способе формирования белковых пленок путем нанесения монослоя иммобилизующего агента на твердую подложку по методу Ленгмюра-Блоджетт с последующей адсорбцией на ней белковых молекул из водного раствора путем молекулярной самосборки и повторного нанесения монослоя иммобилизующего агента на поверхность образованного белкового слоя в качестве иммобилизующего агента взят ацетопивалинат целлюлозы.

Авторами был проведен поиск иммобилизирующих соединений органической природы, обладающих достаточной связывающей способностью по отношению к белкам и устойчивостью при хранении с сохранением структурно-функциональных свойств адсорбиуемых ферментов. Также важную роль играет снижение финансовых затрат на используемые реактивы. Таким требованиям отвечает найденный в процессе поиска органический носитель – ацетопивалинат целлюлозы отечественного производства, стоимость которого на 3 порядка ниже фосфолипида. Его использование в качестве иммобилизующего соединения значительно удешевляет получение образцов. Ацетопивалинат целлюлозы отличается термоокислительной устойчивостью, не разрушается при использовании, не загрязняет экосистему его метаболитами, хранится более 7 лет на воздухе при комнатной температуре.

Сущность предлагаемого способа нанесения упорядоченных белковых пленок на твердую подложку основана на использовании в качестве иммобилизующего слоя для белковых молекул смешанного сложного эфира целлюлозы – ацетопивалината целлюлозы, который, не влияя на состояние белковой молекулы, повышает степень упорядоченности молекул белка (микрорельеф белковой пленки с шероховатостью не более 5 нм), увеличивает плотность заполнения белковой пленки и обеспечивает экономическую эффективность предлагаемого способа (снижение стоимости иммобилизирующего слоя и условий его хранения, а также экономное расходование дорогостоящих белковых препаратов). Прочность иммобилизации белка подтверждается увеличением степени плотности заполнения белковой пленки.

Выполнение способа заключается в том, что наносят раствор ацетопиволината целлюлозы на поверхность субфазы в ленгмюровской ванне и формируют ленгмюровский монослой при давлении 30 мН/м. Далее монослой полимера переносят методом вертикального лифта (Ленгмюра-Блоджетт) на гидрофобизированную твердую подложку, которую помещают в кювету на дно ванны. После удаления ленгмюровского слоя с поверхности субфазы кювету, наполненную водой, вынимают из ванны. Иммобилизацию белка на монослой ацетопивалината целлюлозы осуществляют в кювете путем введения в водную среду аликвоты водного буферного раствора белка. Проводят адсорбцию белковых молекул при комнатной температуре (или в холодильнике), промывают подложку водой, кювету с иммобилизованным белком снова помещают в ленгмюровскую ванну. Формируют новый монослой полимера, через который вынимают подложку уже с иммобилизованным белком. Конечный вариант иммобилизованной пленки схематично изображен на фиг.3. В качестве белковых молекул могут быть иммобилизованы металлоферменты, такие как щелочная фосфатаза, каталаза.

Характеристика структурно-функциональных свойств ацетопивалината целлюлозы

Получение ацетопивалината целлюлозы проводят методом смешанных ангидридов с использованием ангидрида трифторуксусной кислоты. Такая методика позволяет целенаправленно синтезировать эфиры целлюлозы с определенным количеством гидроксильных и ацитильных групп в глюкозидном кольце, что особенно важно при получении соединений, используемых в дальнейшем для формирования устойчивых ленгмюровских монослоев на жидкой субфазе и пленок Ленгмюра-Блоджетт. Оптимальное соотношение гидрофильных и гидрофобных остатков в жесткоцепном полимере – ацетопивалинате целлюлозы улучшает его иммобилизующие свойства.

Ацетопивалинат целлюлозы имеет следующее строение:

Количество заместителей ОН-группы (на 300 глюкозидных колец) в молекуле целлюлозы: х=175 (пивалинат), у=10 (ацетат), z – 115 (гидроксильные ОН – группы, оставшиеся незамещенные). Такая структура позволяет варьировать иммобилизующую способность полимера при изменении количества замещенных ОН-групп.

Монослой ацетопивалината целлюлозы не нуждается в специальном химическом модифицировании после нанесения на твердую подложку (как в патенте Р 63231257 от 1988-09-27, Yano E.J. и др.), т.к. использование ленгмюровской технологии предопределяет ориентацию гидрофильных функциональных групп эфира целлюлозы на межфазной границе воздух-вода. Это делает удобным его использование для создания плотной упаковки упорядоченного слоя адсорбированного белка, в отличие от липидного монослоя, использование которого в ряде случаев дает дефектное заполнение белкового монослоя.

2. Примеры реализации заявляемого способа

2.1. Для формирования белоксодержащей пленки были использованы:

Ацетопивалинат целлюлозы – 0,3 мг/мл;

Каталаза – 2,5 мг/мл;

Щелочная фосфатаза – 250 мкг/мл;

Кремниевые подложки размером 10×30 мм²;

Ленгмюровская ванна с весами Вильгельми для измерения поверхностного давления ленгмюровского монослоя с чувствительностью 0,0001Н/м и с подвижным барьером.

В качестве подложек использованы полированные кремниевые пластины монокристаллического кремния (100).

2.2. Получение иммобилизующего монослоя ацетопивалината целлюлозы на твердой подложке.

На поверхность водной субфазы (тридистиллированная вода рН 6,6) в ленгмюровской ванне наносят иммобилизующий компонент – 70 мкл раствора (0,3 мг/мл) ацетопивалината целлюлозы в хлороформе. После растекания раствора на поверхности водной субфазы и удаления растворителя (через 15 мин) монослой поджимают барьером со скоростью 0,01 м²/мин. Монослой поджимают до величины поверхностного давления Р=30 мН/м, переносят на твердую подложку (гидрофобизированный кремний) размером 30×10 мм методом вертикального лифта со скоростью 3 мм/мин. Подложку с монослоем иммобилизирующего агента помещают в кювету, находящуюся на дне ленгмюровской ванны. После удаления с поверхности субфазы монослоя ацетопивалината целлюлозы подложку в кювете, заполненной водой, вынимают из ванны и используют для адсорбции белка.

2.3. Иммобилизация белка на ЛБ-монослое ацетопивалината целлюлозы на твердой подложке

Адсорбционную иммобилизацию белковых молекул щелочной фосфатазы на перенесенном монослое иммобилизирующего ацетопивалината целлюлозы проводят из рабочего раствора с концентрацией белка 20 мкг/мл в течение 10 часов при комнатной температуре. Иммобилизацию белка каталазы из раствора (2 мг/мл) проводят на ЛБ монослое ацетопивалината целлюлозы в аналогичных условиях. Процедура формирования белковых пленок на основе вышеуказанных ферментов является оптимальной.

Для формирования защитного покровного слоя ацетопивалината на поверхности белкового монослоя кювету с образцом помещают на дно ленгмюровской ванны (субфаза без монослоя иммобилизирующего компонента). Далее формируют на субфазе монослой ацетопивалината целлюлозы и подложку вынимают через вновь сформированный монослой. На белковый слой переносят монослой иммобилизирующего компонента при поверхностном давлении 30 мН/м со скоростью вертикального движения подложки 1,5 мм/мин. Таким образом получены образцы иммобилизованных белков по предлагаемому способу.

2.4. Оценка методом атомно-силовой микроскопии морфологии поверхности белоксодержащих пленок.

Сравнительный анализ данных, полученных на атомно-силовом микроскопе по белковым пленкам на липидном слое (Фиг.2) и на целлюлозных слоях с щелочной фосфатазой (Фиг.4) и с каталазой (Фиг.5), доказывает, что применение ацетопивалината целлюлозы в качестве иммобилизующего агента значительно улучшает упорядоченность и прочность белковой пленки, что позволяет использовать предлагаемый способ для изготовления модельных систем клеточной мембраны и для создания активных элементов биосенсорных устройств.

Формула изобретения

Способ формирования белковых пленок на твердых подложках путем нанесения монослоя иммобилизующего агента по технологии Ленгмюра-Блоджетт с последующей адсорбцией на монослое белковых молекул из водного раствора путем молекулярной самосборки и повторного нанесения монослоя иммобилизующего агента на поверхность образованного белкового слоя, отличающийся тем, что в качестве иммобилизующего агента используют ацетопивалинат целлюлозы.

РИСУНКИ