Патент на изобретение №2316765

(54) СПОСОБ РАННЕГО ВЫЯВЛЕНИЯ ОСЛАБЛЕНИЯ АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СОСУДОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и ангиологии. Для раннего выявления ослабления антитромботической активности сосудов у больного определяют: индекс антиагрегационной активности сосудов, активность антитромбина III и активаторов плазминогена до и после временной венозной окклюзии с вычислением индекса синтеза активаторов AT III и индекса фибринолитической активности сосудистой стенки. Полученные результаты обрабатываются системным многофакторным анализом с получением значения общего антитромботического потенциала сосудов (X_{Bi ОАПС}). При значении X_{Bi ОАПС} 0,201 и выше судят об отсутствии снижения антитромботической активности сосудистой стенки, что не требует лечебных вмешательств. При значении X_{Bi ОАПС} в интервале 0,200-0,070 больные входят в группу риска по развитию снижения антитромботической активности сосудистой стенки и нуждаются в ежемесячном наблюдении врача с обязательным оздоровлением образа жизни. При значении X_{Bi ОАПС} 0,069 и ниже имеется снижение антитромботической активности сосудистой стенки, требующее коррекции ее состояния. Использование способа позволяет повысить эффективность раннего выявления ослабления антитромботической активности сосудов. 1 ил., 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и ангиологии.

Известны методы исследования сосудистых функций (Баркаган З.С., Момот А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза. М., 1999. – 214 с.), однако способа раннего выявления ослабления антитромботической активности сосудов в целом не разработано.

В клинической лабораторной диагностике применяется метод исследования антиагрегационной активности сосудистой стенки, оценивается уровень антитромбина III и активность плазминногена до и после временной венозной окклюзии.

Однако никогда ранее данные методы не объединяли в единый диагностический комплекс, а полученные результаты с помощью системного многофакторного анализа не выражали одним числом, по которому можно было судить о развитие раннего ослабления антитромботической активности сосудов.

Целью изобретения является повышение эффективности раннего выявления ослабления антитромботической активности сосудов.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что для раннего выявления ослабления антитромботической активности сосудов больным проводится следующий диагностический комплекс исследований: определяется индекс антиагрегационной активности сосудов, активность антитромбина III и эуглобулиновый лизис, отражающий активность плазминогена до и после временной венозной окклюзии с вычислением индекса синтеза активаторов AT III и индексов фибринолитичсской активности сосудистой стенки. Полученные результаты обрабатываются системным многофакторным анализом с получением значения общего антитромботического потенциала сосудов (ОАПС), который позволяет выявлять ослабление их антитромбогенной активности на ранних этапах.

Способ позволяет своевременно диагносцировать нарушения ОАПС у пациентов, что дает возможность назначать на ранних этапах соответствующее лечение, переводящее ОАПС на уровень, близкий к таковому для здоровых людей. При регулярном обследовании в последующем согласно заявляемого способа возможен контроль поддержания ОАПС в оптимальном режиме функционирования, что позволит существенно снизить риск тромботических осложнений, уменьшить число случаев временной нетрудоспособности, выходов на инвалидность и снизить смертность среди сосудистых больных.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

На плечо руки, из сосудов которой еще не производился забор крови, накладывается манжетка сфигмоманометра и создается давление на 10 мм рт.ст. выше систолического. Через 3 минуты производилось взятие 9 мл крови в 1 мл 3,8% раствора цитрата натрия. Ее немедленно центрифугировали 5 минут при 1000 об/мин для получения богатой тромбоцитами плазмы. Плазму отсасывали пипеткой и сразу же помещали в тающий лед, где хранили до начала исследований. Повторно пробу центрифугировали 20 минут при 3000 об/мин для получения бестромбоцитной плазмы. После подсчета количества тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазмы, полученной до венозного застоя (подробно описано ниже), ее разводили бедной тромбоцитами плазмой (БеТП), взятой до (1 проба) и после (2 проба) венозного застоя до концентрации 200000 тромбоцитов/мкл. Полученную смесь встряхивали и инкубировали 10 минут при 20-22°С. Затем проводили агрегацию тромбоцитов (AT) с коллагеном (разведение 1:2 основной суспензии) на стекле.

Оценка AT для проведения данного исследования осуществляется следующим способом (Шитикова А.С. В кн.: Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний./Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян. СПб.: 1999. С.49-52).

Кровь забирают с цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин для получения богатую тромбоцитами плазму (БТП). Часть плазмы отбирают, а оставшуюся центрифугируют при 3000 об/мин, в течение 20 мин, получая бедную тромбоцитами плазму (БеТП). БТП стандартизируют по числу тромбоцитов путем разбавления исходной БТП аутологичным образцом БеТП (полученной до венозного застоя – 1-я проба или после него – 2-я проба) до 200·10⁹/л. Концентрация кровяных пластинок в исходной БТП подсчитывается в камере Горяева (в 50 больших квадратах). Объемы смешиваемых БТП и БеТП определяют по формуле:

V_БеТП=V_БТП·[(N/200000)-1],

V_БеТП – объем бедной тромбоцитами плазмы,

V_БЕП – объем богатой тромбоцитами плазмы,

N – счетная концентрация тромбоцитов в исходной БТП (клеток/мкл).

Из отобранного объема стандартизированной плазмы на предметное стекло наносят 0,02 мл плазмы и другой пипеткой 0,02 мл р-ра индуктора коллагена в стандартной концентрации (разведение 1:2 основной суспензии). Стеклянной палочкой смешивают плазму с индукторами и включают секундомер. Смесь перемешивают так, чтобы жидкость занимала окружность диаметром около 2 см.

Покачивая стекло круговыми движениями в проходящем свете осветителя, на черном фоне следят через лупу за возникновением агрегатов. При появлении отчетливых агрегатов, просветлении раствора и прилипании части агрегатов к стеклу секундомер отключают, фиксируя время агрегации тромбоцитов.

Реакцию повторяют по 2-3 раза в 1-й и 2-й пробе, находя для каждой из них среднее арифметическое значение.

По степени торможения агрегации тромбоцитов после венозного застоя судят об антиагрегационной активности плазмы крови, обусловленной поступлением в кровоток простациклина из сосудистой стенки. Индекс антиагрегационной активности сосудистой стенки (ИААСС) при исследовании AT на стекле рассчитывали по формуле:

Нормальными значениями для коллагена можно считать ИААСС 1,50-1,60.

Определение антитромбогенных свойств сосудистой стенки, зависящих от продукции веществ, активирующих антитромбин III, оценивая его базальный уровнь до – и после временной дозированной ишемии стенки вены приведены ниже (Баркаган З.С., Момот А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза. М., 1999, – 214 с.).

Принцип метода основан на выявлении снижения активности (в отсутствии гепарина) в плазме антитромбина III (AT III), которую определяют по способности исследуемой плазмы инактивировать тромбин, для чего ее предварительно обрабатывают сорбентом гепарина, затем подвергают тепловой дефибринации и смешивают со стандартным количеством тромбина. После инкубации смеси в ней определяют остаточную коагуляционную активность тромбина. По уровню снижения активности тромбина в процентах от нормы оценивают активность AT III в исследуемой плазме.

Используются следующие реактивы. 1. Трис-HCl буфер 0,05 М, рН 7,4. 2. Раствор тромбина в буфере: 0,2 мл раствора должны свертывать 0,3 мл 0,4% раствора фибриногена за 15-16 сек. Рабочий раствор тромбина готовят в пластиковой или силиконированной пробирке, хранят при комнатной температуре и используют в тесте в день исследования. 3. Сорбент гепарина Гепасорб-1 (фирма “Технология-Стандарт”). 4. Свежеприготовленный раствор фибриногена в концентрации 3,5-4,0 г/л, который применяют для тестирования остаточной активности тромбина. Допускается замена раствора фибриногена нормальной бедной тромбоцитами цитратной плазмой, разведенной буфером в 2 раза; 5. Свежая цитратная бедная тромбоцитами плазма, полученная от 6-8 здоровых людей, или лиофилизированная фирменная, с известной активностью AT III, которую используют для построения калибровочного графика.

Материалом для исследования служит цитратная бедная тромбоцитами плазма.

Для приготовления сорбированной и дефибринированной плазмы в пробирке смешивают 10 мг сорбента гепарина с 1,0 мл исследуемой плазмы. Постоянно встряхивая пробирку, перемешивают ее содержимое при комнатной температуре в течение 8 мин, исключая образование пены и осадка на ее дне. После этого, смесь центрифугируют в течение 2 мин при 1000-1500 об/мин. Плазму в надосадке переносят в чистую пробирку и дефибринируют на водяной бане при +56°С в течение 6 мин, после чего вновь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, снимают надосадочную часть и исследуют в течение первых 2 ч.

Ход определения. В пробирку вносят 0,4 мл рабочего раствора тромбина и прогревают его на водяной бане при +37°С в течение 2 мин. Затем добавляют 0,1 мл исследуемой адсорбированной и дефибринированной плазмы, включают секундомер. Через 2 мин (точно!) 0,2 мл смеси переносят в пробирку с 0,3 мл раствора фибриногена (или разведенной нормальной плазмы), предварительно подогретой до +37°С. Немедленно включают секундомер и регистрируют время свертывания.

По калибровочной кривой находят активность AT III в процентах.

Построение калибровочной кривой проводят следующим образом. Плазму здоровых людей подвергают дефибринированию, как указано выше. Затем из нее готовят разведения для построения калибровочной кривой в соответствии с табл.1.

С каждым из разведении определяют время свертывания по указанной выше методике. Все измерения проводят трижды, рассчитывают средний результат. При построении калибровочной кривой по логарифмической оси ординат откладывают время свертывания в секундах, по оси абсцисс – активность AT III в % в соответствии с указанными выше разведениями. Примерная калибровочная кривая приведена на чертеже.

Калибровочную кривую для одного типа и одной серии тромбина и буфера строят однократно. Периодически контролируют лишь активность рабочего раствора тромбина.

В норме без венозной окклюзии активность AT III составляет 85-115%. При взятии крови после временной венозной окклюзии, как описано в методе по оценке антиагрегационной активности сосудов, и определении в ней AT III возможно косвенно оценить уровень синтеза в стенке сосуда тканевых активаторов AT III. На фоне временной венозной окклюзии активность AT III повышается и находится в границах 120-143%. Рассчитывается индекс синтеза активаторов AT III в сосудах (ИСААС) путем деления величины активности AT III на фоне венозной окклюзии на величину AT III без нее. В норме он равен 1,20-1,45.

Активность синтеза тканевых активаторов плазминогена по времени лизиса эуглобулинового сгустка до – и после временной венозной окклюзии оценивали следующим образом.

Принцип метода заключается в осаждении эуглобулиновой фракции плазмы, при этом основные ингибиторы фибринолиза, в частоности ₂-антиплазмином, остаются в надосадочной части и удаляются. Поэтому эуглобулиновый лизис отражает активность фибринолиза в условиях исключения ингибирующего действия антиплазминов. Его скорость отражает, в основном, количество плазминогена в плазме и степень его активации. Определяют время спонтанного лизиса сгустка, получаемого из эуглобулиновой фракции плазмы при добавлении к ней раствора хлорида кальция.

Используются следующие реактивы 1.1% раствор уксусной кислоты. 2. 0,277% раствор хлорида кальция. 3. Буфер Михаэлиса или трис-НС – буфер, 0.05 М, рН 7,3-7,4.

Материалом для исследования служит цитратная бедная тромбоцитами плазма до и после временной венозной окклюзии.

Ход определения. Для получения эуглобулиновой фракции к 8,0 мл дистиллированной воды добавляют 0,15 мл 1% уксусной кислоты и 0,5 мл исследуемой плазмы. После 30-минутного охлаждения смеси в холодильнике при +2-8°С эуглобулины осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 7 мин. Надосадочную жидкость сливают, пробирку осушают опрокидыванием на фильтровальную бумагу. Осадок эуглобулинов разводят в 0,5 мл буфера и помещают на водяную баню (+37°С). Затем, не вынимая пробирку из бани, добавляют 0,5 мл раствора хлорида кальция, осторожно перемешивают покачиванием пробирки (не встряхивая!), включают секундомер и инкубируют на водяной бане при +37°С. Регистрируют время с момента добавления хлорида кальция до полного растворения сгустка.

Результат выражают в минутах. В норме время спонтанного лизиса эуглобулинового сгустка составляет 180-240 мин. После временной венозной окклюзии время лизиса снижается, находясь в границах 126-170 мин. При делении величины длительности спонтанного лизиса эуглобулинового сгустка до окклюзии на величину после рассчитан индекс фибринолитической активности сосудистой стенки (ИФАСС), в норме равный 1,40-1,50.

Для каждой лаборатории необходимо обследование группы здоровых людей, чтобы найти средние нормативные значения с расчетом S² по всем трем методикам для последующих расчетов.

По каждой методике у каждого больного для большей точности диагностики проводят тест 3-4 раза с вычислением среднеарифметических значений, которые используют в последующих расчетах и вычислении S².

Для определения весомости отдельных исследуемых параметров у сосудистых больных и вычисления у них общего антитромботического потенциала сосудов применялся системный многофакторный анализ, позволяющий переводить многомерные количественные характеристики исследуемого процесса с несопоставимыми абсолютными значениями в сопоставимые относительные величины (Применение методов морфометрии и статистического анализа в морфологических исследованиях. Сост. М.В.Углова, Б.А.Углов, В.В.Архипов и др., Куйбышев, 1982. – 47 с.). Расчет производился по формулам:

X_j – исследуемый параметр, – нормативный параметр, – относительная разность.

Pi – весовой коэффициент (коэффициент влияния), а – постоянный множитель (в наших исследованиях а=0,1), _j – среднеквадротичское отклонение значения X_j в относительных единицах.

S_i ² – дисперсия исследуемого параметра X_i, n_i – количество наблюдений при определении X_i, S₀ ² – дисперсия нормативного параметра X₀, n₀ – количество наблюдений при определении X₀.

Х_{Bi ОАПС} – величина, интегрально характеризующая исследуемый процесс в заданный срок (в относительных единицах).

Сочетанное применение описанных методов с последующей обработкой полученных значений ИААСС, ИСААС и ИФАСС системным многофакторным анализом с определением общего антитромботического потенциала сосудов (X_{Bi ОАПС}) – норма 0,201 и выше, позволяет выявлять у пациентов риск развития ослабления антитромботической активности сосудов (X_{Bi ОАПС} от 0,200 до 0,070), что требует нормализации образа жизни, стабильной нормализации артериального давления и ежемесячного контроля состояния сосудистых функций. При значении X_{Bi ОАПС} от 0,069 и ниже – необходимо немедленно проводить лечение пациентов.

Внедрение данного способа ранней диагностики ослабления антитромботической активности сосудов у различных категорий больных в практику лечебных учреждений позволит решить ряд насущных социально-экономических проблем современности. Ранняя диагностика у различных больных позволит своевременно начинать лечение тромбофиллии, что сократит у этих пациентов сроки временной нетрудоспособности, профилактирует инсульты и инфаркты, уменьшит число выходов на инвалидность и снизит смертность среди данного контингента больных.

Пример 1. Больная Т., 44 года, страдающая артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 3 лет, ведущая здоровый образ жизни, обследована во время диспансерного осмотра по поводу артериальной гипертонии. У больной была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой ИААСС, содержания антитромбина III и эуглобулинового лизиса до и после венозной окклюзии и вычислением ИСААС, ИФАСС и общего антитромботического потенциала сосудов.

У пациентки не было выявлено признаков угнетения антитромботической функции сосудистой стенки. ИААСС составлял 1,5, ИСААС и ИФАСС составляли 1,3 и 1,4 соответственно. Общий антитромботический потенциал сосудов составил Х_{Bi ОАПС}=0,212. Больной было рекомендовано и далее контролировать артериальное давление и вести здоровый образ жизни. Так, исследование функций сосудистой стенки у нее через 12 нед. не выявило отрицательных изменений значения общего антитромботического потенциала сосудов (Х_{Bi ОАПС}=0,217).

Пример 2. Больная С., 49 лет, страдающая артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 6 лет, обследована во время диспансерного осмотра по поводу артериальной гипертонии. У больной была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой ИААСС, содержания антитромбина III и эуглобулинового лизиса до и после венозной окклюзии и вычислением ИСААС, ИФАСС и общего антитромботического потенциала сосудов.

У пациентки были выявлены признаки угнетения антитромботической функции сосудистой стенки. ИААСС составлял 1,29. ИСААС и ИФАСС составили 1,18 и 1,34 соответственно. Общий антитромботический потенциал сосудов составил Х_{Bi ОАПС}=0,152. Больной было рекомендовано для адекватного контроля артериального давления и нормализации состояния сосудистой стенки вести здоровый образ жизни и принимать нормодипин 10 мг 1 раз в сутки и обследоваться ежемесячно. Так, исследование функций сосудистой стенки через 12 нед. не выявило отрицательных отклонений в ИААСС – 1,5, ИСААС – 1,42 и ИФАСС – 1,49. Значение общего антитромботического потенциала сосудов у нее находилось на уровне нормы – Х_{Bi ОАПС}=0,208.

Пример 3. Больная М., 60 лет, страдающая артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 14 лет, систематически не лечащаяся, обследована во время обращения в поликлинику по поводу острого респираторного вирусного заболевания. У больной была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой ИААСС, ИСААС и ИФАСС и вычислением общего антитромботического потенциала сосудов.

У пациентки были выявлены выраженные признаки угнетения антитромботической функции сосудистой стенки. ИААСС составлял – 1,05, ИСААС 1,07 и ИФАСС 1,12. Общий антитромботический потенциал сосудов составил X_{Bi ОАПС}=0,051. Больной был назначен лечебный комплекс из диеты богатой зеленью и витаминами и ограниченной по жирам и углеводам, дозированных физических нагрузок и нормодипина 10 мг 1 раз в сутки. Исследование функций сосудистой стенки проводилось ежемесячно, через 8 мес выявило значительное улучшение состояния сосудистых функций (X_{Bi ОАПС}=0,162), а через 12 мес отмечена нормализация значения общего антитромботического потенциала сосудов (X_{Bi ОАПС}=0,202). Дальнейшее соблюдение данных больной рекомендаций позволило поддержать в последующем исследованные параметры антитромботической активности сосудов в нормальных границах.

Пример 4. Больная А., 46 лет, страдающая хроническим персистирующим гепатитом, стадия неполной ремиссии на протяжении 4 лет, ведущая здоровый образ жизни и соблюдающая рекомендации врачей, обследована во время диспансерного осмотра. У больной была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой ИААСС, содержания антитромбина III и эуглобулинового лизиса до и после венозной окклюзии и вычислением ИСААС, ИФАСС и общего антитромботического потенциала сосудов.

У пациентки были выявлены легкие признаки угнетения антитромботической функции сосудистой стенки. ИААСС составлял 1,45, ИСААС и ИФАСС составляли 1,15 и 1,3 соответственно. Общий антитромботический потенциал сосудов составил X_{Bi ОАПС}=0,191. Больной было рекомендовано и далее вести здоровый образ жизни и присоединить на 3 мес к лечению эссенциале по 1 капс. 3 раза в день. Исследование функций сосудистой стенки у нее через 12 нед. не выявило отрицательных изменений оцениваемых параметров (ИААСС=1,5, ИСААС=1,35 и ИФАСС=1,4), значение общего антитромботического потенциала сосудов также соответствовало норме (X_{Bi ОАПС}=0,217).

Пример 5. Больная М., 51 год, с хроническим пиелонефритом стадии обострения. При осмотре выяснено, что больная страдает им на протяжении 6 лет с обострениями 2 раза в год. Больная обследована во время посещения уролога по поводу данного заболевания. У больной была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой ИААСС, содержания антитромбина III и эуглобулинового лизиса до и после венозной окклюзии с вычислением ИСААС, ИФАСС и общего антитромботического потенциала сосудов.

У пациентки были выявлены признаки угнетения антитромботической функции сосудистой стенки. ИААСС составлял 1,26. ИСААС и ИФАСС составили 1,17 и 1,29 соответственно. Общий антитромботический потенциал сосудов составил X_{Bi ОАПС}=0,148. Больной было рекомендовано пройти курс стандартного лечения по поводу обострения хронического пиелонефрита и принимать токоферола ацетат 50% 0,2 г по 1 капс. 2 раза в день в течение 3-х месяцев. Исследование функций сосудистой стенки через 12 нед. выявило нормализацию ИААСС – 1,52, ИСААС – 1,44 и ИФАСС – 1,48. Значение общего антитромботического потенциала сосудов у нее находилось на уровне нормы – X_{Bi ОАПС}=0,203.

Пример 6. Больная М., 40 лет, с геморрагическим васкулитом в стадии обострения. При осмотре выяснено, что страдает геморрагиическим васкулитом на протяжении 7 лет, систематически не лечится, обследована во время обследования на дому. У больной была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой ИААСС, ИСААС и ИФАСС и вычислением общего антитромботического потенциала сосудов.

У пациентки были выявлены выраженные признаки угнетения антитромботической функции сосудистой стенки. ИААСС составлял – 1,07, ИСААС – 1,09 и ИФАСС – 1,11. Общий антитромботический потенциал сосудов составил X_{Bi ОАПС}=0,050. Больной был назначен лечебный комплекс из диеты богатой зеленью, витаминами и белком с ограничением жиров животного происхождения, дозированных физических нагрузок и стандартного лечения геморрагического васкулита. Исследование функций сосудистой стенки проводилось ежемесячно, через 5 мес выявило значительное улучшение состояния сосудистых функций (X_{Bi ОАПС}=0,174), а через 8 мес отмечена нормализация значения общего антитромботического потенциала сосудов (X_{Bi ОАПС}=0,206) с нормализацией ИААСС – 1,55, ИСААС – 1,32, ИФАСС – 1,43. Дальнейшее соблюдение данных больной рекомендаций позволило поддержать в последующем исследованные параметры антитромботической активности сосудов в нормальных границах.

Формула изобретения

Способ раннего выявления ослабления антитромботической активности сосудов, отличающийся тем, что определяют антиагрегационную активность сосудов, динамику антитромбина III и эуглобулинового лизиса на фоне временной венозной окклюзии при оценке у каждого пациента по 3-4 раза исследуемых параметров при одном обследовании, находят индекс антиагрегационной активности стенки сосудов, индекс синтеза активаторов антитромбина III в сосудах и индекс фибринолитической активности сосудистой стенки, вычисляют среднее арифметическое значение показателей, которые обрабатывают с помощью системного многофакторного анализа, переводя каждый из определяемых показателей в сопоставимые относительные величины, на основании которых с учетом весомого коэффициента, определяемого для каждого показателя на основании среднеквадратического отклонения для данного показателя и постоянного множителя, равного 0,1, рассчитывают значение общего антитромботического потенциала сосудов – X_{Bi ОАПС}, по значению которого в ранние сроки можно диагносцировать развитие снижения антитромботической активности сосудов: при значении X_{Bi ОАПС} 0,201 и выше отсутствует снижение антитромботической активности сосудистой стенки, что не требует лечебных вмешательств, при значении X_{Bi ОАПС} в интервале 0,200-0,070 больные входят в группу риска по развитию снижения антитромботической активности сосудистой стенки и нуждаются в ежемесячном наблюдении врача с обязательным оздоровлением образа жизни, при значении X_{Bi ОАПС} 0,069 и ниже имеется снижение антитромботической активности сосудистой стенки, требующее коррекции ее состояния.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 29.09.2009

Извещение опубликовано: 10.10.2010 БИ: 28/2010