Патент на изобретение №2316764

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ ПРИГОДНОСТИ ЛИЦ ДЛЯ РАБОТЫ В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ УГОЛЬНОЙ ПЫЛИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к цитогенетике человека. Определение профессиональной пригодности лиц выполняют путем исследования клеток крови. Получают препарат хромосом, окрашивают его путем нанесения азотнокислого серебра и определяют цитогенетические показатели: суммарную активность AgЯОР, количество Ag-положительных ЯОР, аргентофильность D-хромосом, аргентофильность G-хромосом, ассоциативный индекс, число ассоциаций на клетку с ассоциациями, число ассоциирующих акроцентриков на клетку с ассоциациями. На основании полученных данных при учете индивидуального возраста рассчитывают уровень вероятности высокого уровня хромосомных аберраций и при его значении 50% и менее определяют профессиональную пригодность испытуемого для работы в условиях повышенного содержания угольной пыли. Использование способа позволяет повысить точность определения профессиональной пригодности испытуемого для работы в условиях повышенного содержания угольной пыли. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к цитогенетике человека, и может быть использовано для профессионального отбора кадров для предприятий с высокой запыленностью производственной среды.

Известен способ прогнозирования профессиональной пригодности лиц для работы в условиях с повышенной вредностью (а.с. SU 1392507, Кл. G01N 33/48, опубл. 30.04.88) путем проведения электрофореза сыворотки крови в полиакриламидном геле и определения типа гаптоглобина и компонента комплемента С3. По носительству генетических маркеров гаптоглобина 1-2 и компонента комплемента С3 судят о пригодности лиц для работы в условиях химических производств. К недостаткам данного способа следует отнести то, что выявлен лишь один тип генетического полиморфизма (сочетание компонента комплемента С₃ и гаптоглобина 1-2), носители которого имеют более широкие адаптационные возможности при работе во вредных условиях химических производств. Все остальные индивиды автоматически причисляются к группе риска и им не рекомендована работа во вредных условиях. Не указывается, в отношении каких именно химических веществ – токсикантов – чувствителен данный способ. Химические производства отличаются высоким разнообразием условий труда, и остается неясным, для каких именно производственных участков пригоден данный метод.

Также известен способ прогнозирования профессиональной пригодности лиц для работы в условиях повышенного содержания фтора (а.с. SU 1720387 А1, Кл. G01N 33/48) путем анализа крови и определения группы крови, резус-фактора, типа группо-специфического компонента сыворотки крови, наличия линии С и узора на четвертой межпальцевой подушечке ладони левой руки. Рассчитывают вероятность развития профессионального флюороза по разработанной формуле, куда вписываются индивидуальные значения испытуемого. В том случае, если рассчитанный показатель не превышает 0.5, определяют пригодность обследуемого донора к работе в условиях повышенного содержания фтора.

К недостаткам данного способа следует отнести невозможность осуществления анализа в образцах крови малого объема (требуется не менее 5 мл крови из локтевой вены, что может оказаться травматичным для донора). Кроме того, способ подразумевает использование трех разных методов анализа (определение наличия агглютинации клеток крови, проведение электрофореза сыворотки, получение и анализ отпечатков ладонных узоров), что подразумевает работу как минимум трех квалифицированных лаборантов над каждой пробой. Это значительно удлиняет время проведения анализа и выполнимо далеко не в каждой лаборатории.

Наиболее близким к заявленному способу является способ определения профессиональной пригодности лиц для работы в условиях с повышенной вредностью по генетическим маркерам (а.с. SU 1621718 А1, Кл. G01N 33/48, приор. 22.04.88). Суть метода заключается в том, что у испытуемого забирают кровь из локтевой вены, культивируют ее 48 часов в присутствии фитогемагглютинина (ФГА), для накопления хромосом в стадии метафазы используют обработку колхицином. Затем проводят гипотоническую обработку и фиксацию клеток. Полученную суспензию раскапывают на охлажденные предметные стекла и высушивают на воздухе. С помощью С-метода дифференциальной окраски хромосом выявляют экстремальные варианты С-полиморфизма. Для этого препараты окрашивают красителем Гимза после предварительной денатурации в насыщенном растворе Ва(ОН)₂ и инкубации в стандартном солевом растворе 2×SSC при 60°С. Оценку С-сегментов проводят полуколичественным методом по 5-балльной системе. За экстремальные варианты принимают варианты: 1, 5 баллов, перицентрические инверсии. Согласно литературным данным наличие в генотипе таких вариантов сопряжено с высокой частотой хромосомных нарушений. Таким образом, при наличии в генотипе экстремальных вариантов гетерохроматина судят о непригодности лиц для работы на предприятиях с повышенной токсической вредностью.

К недостаткам данного способа следует отнести:

– невозможность корректного определения индивидуальной профессиональной пригодности у 80-90% рабочих (способ позволяет выявлять носителей экстремальных вариантов С-полиморфизма, высокочувствительных к действию мутагенов, но таких индивидов в популяции обычно очень мало – не более 10-20%);

– невысокую точность из-за использования анализа только структурных особенностей хромосом без учета их функциональных возможностей;

– техническую сложность в исполнении, заключающуюся в высокой чувствительности метода к малейшим нюансам выполнения процедуры окрашивания, что обусловливает необходимость подготовки высококвалифицированного лаборанта;

– длительность исполнения процедуры (продолжительность С-метода окрашивания каждого препарата хромосом составляет 50-60 минут).

Основными задачами изобретения являются: создание индивидуального подхода в оценке профессиональной пригодности к работе в условиях высокого содержания угольной пыли, повышение точности путем привлечения в систему прогноза не только структурных, но функциональных особенностей генотипа доноров, упрощение технической процедуры исполнения, уменьшение времени выполнения процедуры (окрашивание препаратов – 15 мин).

Это достигается за счет того, что в способе определения профессиональной пригодности путем исследования клеток периферической крови, включающего получение препарата хромосом, предлагается проведение его окрашивания путем нанесения на препарат азотнокислого серебра и определения следующих цитогенетических показателей: суммарная активность AgЯОР, количество Ag-положительных ЯОР, аргентофильность D-хромосом, аргентофильность G-хромосом, ассоциативный индекс, число ассоциаций на клетку с ассоциациями, число ассоциирующих акроцентриков на клетку с ассоциациями, при учете индивидуального возраста, используя которые в дальнейшем рассчитывают уровень вероятности высокого уровня хромосомных аберраций и при его значении 50% и менее определяют профессиональную пригодность испытуемого для работы в условиях повышенного содержания угольной пыли. При окрашивании на препарат хромосом наносят азотнокислое серебро и желатиновый проявитель в соотношении 3:1.

Разработка предлагаемого способа направлена на получение индивидуальных прогностических оценок профессиональной пригодности, повышение точности анализа, снижение затрат времени и технической сложности исполнения.

Окрашивание по Ag-методу включает в себя нанесение на препарат азотнокислого серебра с желатиновым проявителем и инкубирование в термостате при 56°С в течение 15 мин. В техническом отношении это более простая и быстрая процедура, чем в способе-прототипе, основанном на использовании С-метода.

Важным аспектом получения качественной окраски хромосом является использование деионизованной воды и химически чистого нитрата серебра (оптимально производства SIGMA). Хранение раствора нитрата серебра – во флаконе темного стекла, при температуре +4°С. Необходимо учитывать быстрое «старение» данного раствора и его помутнение в этом случае раствор использовать нельзя. Желатиновый проявитель также требует еженедельной смены. Для учета цитогенетических показателей используют световой микроскоп с увеличением ×1200-1600 раз.

Способ определения профессиональной пригодности лиц для работы в условиях повышенного содержания угольной пыли выглядит следующим образом: для исследования берут 0,5-1 мл крови из локтевой вены. Для получения препарата хромосом культивирование крови проводят в питательной смеси. Питательную смесь готовят из расчета: среда RPMI-1640 (6 мл), сыворотка крупного рогатого скота (1,5 мл) и 0,1 мл фитогемагглютинина (Па-нЭко). Смесь помещают в стерильные культуральные флаконы и добавляют 0,5-1 мл гепаринизированной крови. Культуральные флаконы выдерживают при 37°С в течение 48 ч. За 2 часа до фиксации в культуры вводят колхицин (0,5 мкг/мл). После гипотонической обработки и фиксации клеток суспензию раскапывают на охлажденные чистые предметные стекла и высушивают над пламенем спиртовки. Препараты «состаривают» в термостате при 37°С в течение 24 часов. Для выявления Ag-блоков на акроцентрических хромосомах окрашивание проводят в следующем порядке:

1) препараты хромосом помещают в раствор 2N муравьиной кислоты на 10 минут и затем высушивают их на воздухе;

2) на препарат наносят AgNO₃ и желатиновый проявитель в соотношении 3:1, затем накрывают покровным стеклом;

3) помещают препарат в термостат (56°С) на 15 минут;

4) удаляют покровное стекло и как можно быстрее ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

Варианты полиморфизма ядрышкообразующих районов хромосом (ЯОР) определяют под световым микроскопом (увеличение ×1200-1600). Оценку размеров Ag-блоков проводят полуколичественным методом в соответствии с рекомендациями МГНЦ РАМН по пятибалльной системе: 0 баллов – окраска отсутствует; 1 балл – Ag-диск меньше ширины хроматиды; 2 балла – Ag-диск примерно равен ширине хроматиды; 3 балла – интенсивная окраска, Ag-диск больше ширины хроматиды; 4 балла – Ag-диск особо крупного размера (экстремальный вариант), значительно больше ширины хроматиды. Анализируют по 25-30 клеток, в каждой из которых подсчитывают следующие показатели: суммарная активность AgЯОР ((+)), количество Ag-положительных ЯОР (Nag(+)), аргентофильность D-хромосом (AGD), аргентофильность G-хромосом (AGG), ассоциативный индекс (АИ), число ассоциаций на клетку с ассоциациями (АСС_МП), число ассоциирующих акроцентриков на клетку с ассоциациями (ХР_В_АСС), возраст поступления на работу (возраст поступ).

Цитогенетические показатели рассчитывают следующим образом.

1. Суммарная активность AgЯОР: подсчитывают суммарный размер Ag-дисков всех 10 акроцентрических хромосом в каждой из 30 клеток и определяют среднее значение для клеток данного индивида.

2. Количество Ag-положительных ЯОР: подсчитывают число Ag-дисков (независимо от их размера) в каждой из 30 клеток и определяют среднее значение для клеток данного индивида.

3. Аргентофильность D-хромосом: определяют средний размер Ag-дисков только D-хромосом в каждой из 30 клеток и определяют среднее значение для клеток данного индивида.

4. Аргентофильность G-хромосом: определяют средний размер Ag-дисков только G-хромосом в каждой из 30 клеток и определяют среднее значение для клеток данного индивида.

5. Ассоциативный индекс: подсчитывают процент клеток ассоциациями. Хромосомы (D и G) считают ассоциирующими, если они сближены в пространстве, ориентированы короткими плечами по направлению друг к другу, имеют в межхромосомном пространстве отчетливо прокрашенные нити серебра.

6. Число ассоциаций на клетку с ассоциациями: подсчитывают среднее число ассоциаций в тех из 30 клеток, где они присутствовали и определяют среднее значение для клеток данного индивида.

7. Число ассоциирующих акроцентриков на клетку с ассоциациями: подсчитывают среднее число хромосом в ассоциациях, в тех из 30 клеток, где они присутствовали и определяют среднее значение для клеток данного индивида.

На основе учета этих показателей разработана процедура прогнозирования генетической чувствительности к комплексу факторов коксохимического производства, т.е. прогнозирования вероятности формирования высокого (более 3%) уровня хромосомных аберраций (ХА).

В результате процедуры пошагового дискриминантного анализа получены ряд коэффициентов дискриминантных функций и классификационная матрица (таблица 1 и 2).

Таблица 1. Коэффициенты дискриминантных функций
Наименование переменных	Частота хромосомных аберраций не превышает 3% А1		Высокая частота хромосомных аберраций (более 3%) А2
(+)	10,46		8,03
Nag(+)	258,04		251,23
AGD	-186,36		-166,24
AGG	20,16		14,95
АИ	2,98		3,14
АСС_МП	57,59		54,76
ХР_В_АСС	-21,17		-22,34
ВОЗРАСТ ПОСТУП	0,94		1,07
Константа	В1		В2
	-1389,9		-1313,3
Таблица 2. Классификационная матрица
Группа		Корректная классификация, %
ХА не превышает 3%		85,71
Высокий уровень ХА		90,47

Рассчитанные дискриминантные функции позволяют прогнозировать возникновение высокого индивидуального уровня хромосомных аберраций у людей, поступающих на работу на коксохимическое производство с вероятностью 90,47% по следующей схеме.

1. В процессе обследования определяют значение показателей:

X1 – суммарная активность AgЯОР

Х2 – количество Ag-положительных ЯОР

Х3 – аргентофильность D-хромосом

Х4 – аргентофильность G-хромосом

Х5 – ассоциативный индекс

Х6 – число ассоциаций на клетку с ассоциациями

Х7 – число ассоциирующих акроцентриков на клетку с ассоциациями

Х8 – возраст поступления на работу

2. Вычисляют значения дискриминантных функций для соответствующих классов:

(1) D₁=B₁+А₁₁*Х₁+A₁₂*X₂+А₁₃*Х₃+А₁₄*Х₄+А₁₅*Х₅+А₁₆*Х₆++A₁₇*X₇+A₁₈*X₈ и

(2) D₂=В₂+А₂₁*Х₁+А₂₂*Х₂+А₂₃*Х₃+А₂₄*Х₄+А₂₅*Х₅+А₂₆*Х₆++А₂₇*Х₇+А₂₈*Х₈,

где D1 и D2 – значения дискриминантных функций.

3. Наблюдение относят к тому классу, значение дискриминантной функции для которого наибольшее из имеющихся.

4. Рассчитывают вероятность формирования высокого уровня хромосомных аберраций по формуле

(3) P=e^D2/(e^D1+e^D2),

где Р – вероятность образования мутаций с частотой выше 3%;

D1 и D2 – дискриминантные функции, рассчитанные по формулам (1) и (2).

Устройство на работу, связанную с воздействием угольной пыли, может быть рекомендовано тем индивидуумам, у которых в результате обследования получена вероятность Р, не превышающая 0,5 (или в процентах – 50% или менее).

Пример 1.

Женщина поступила на работу на коксохимическое производство в 28 лет. В результате цитогенетического анализа генотипа получены следующие значения показателей: суммарная активность AgЯОР – 16,4, количество Ag-положительных ЯОР – 9,70; аргентофильность D-хромосом – 1,70; аргентофильность G-хромосом – 2,04; ассоциативный индекс – 99; число ассоциаций на клетку с ассоциациями – 1,79; число ассоциирующих акроцентриков на клетку с ассоциациями – 3,76.

Подставляя полученные значения в формулу (3), получают: индивидуальная вероятность высокого уровня хромосомных аберраций 87,11%. Этой женщине не может быть рекомендована работа в условиях с повышенной запыленностью, т.к. высока вероятность формирования большого числа хромосомных мутаций.

Пример 2.

Мужчина поступил на работу в коксовый цех Кемеровского ЗАО «Кокс» в 21 год. Цитогенетический анализ позволил определить у него следующие значения показателей: суммарная активность AgЯОР – 22,0, количество Ag-положительных ЯОР – 10,0; аргентофильность D-хромосом – 2,2; аргентофильность G-хромосом – 2,2; ассоциативный индекс – 94; число ассоциаций на клетку с ассоциациями – 1,4; число ассоциирующих акроцентриков на клетку с ассоциациями – 2,5.

Подставляя полученные значения в формулу (3), получают, что индивидуальная вероятность высокого уровня хромосомных аберраций 16,62%. Этот человек может работать в условиях с повышенной вредностью (в коксовом цехе), т.к. вероятность формирования хромосомных мутаций у него невелика.

Формула изобретения

1. Способ определения профессиональной пригодности лиц для работы в условиях с повышенной вредностью путем исследования клеток периферической крови, включающего получение препарата хромосом, его окрашивание и определение вариантов полиморфизма хромосом, отличающийся тем, что окрашивание выполняют нанесением на препарат азотно-кислого серебра и определяют следующие цитогенетические показатели: суммарная активность AgЯОР, количество Ag-положительных ЯОР, аргентофильность D-хромосом, аргентофильность G-хромосом, ассоциативный индекс, число ассоциаций на клетку с ассоциациями, число ассоциирующих акроцентриков на клетку с ассоциациями, при учете индивидуального возраста рассчитывают уровень вероятности высокого уровня хромосомных аберраций и при его значении 50% и менее определяют профессиональную пригодность испытуемого для работы в условиях повышенного содержания угольной пыли.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при окрашивании на препарат хромосом наносят азотно-кислое серебро и желатиновый проявитель в соотношении 3:1.