Патент на изобретение №2316590

(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pE-His8-TrxL-Ar2, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СОДЕРЖАЩИЙ АНТИМИКРОБНЫЙ ПЕПТИД АРЕНИЦИН МОРСКОГО КОЛЬЧАТОГО ЧЕРВЯ Arenicola marina, И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 – ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА, СОДЕРЖАЩЕГО АРЕНИЦИН

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии, генной и белковой инженерии и может быть использовано в медицине и в фармацевтической промышленности. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pE-His8-TrxL-Ar2 размером 4059 п.о., кодирующую гибридный белок His8-TrxL-Ar2, содержащий антимикробный пептид ареницин, состоящую из BglII/XhoI-фрагмента ДНК, содержащего промотор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, участок связывания рибосомы и последовательность гибридного полипептида His8-TrxL-Ar2, содержащего гистидиновый октамер, модифицированный тиоредоксин A(M37L) и ареницин, и BglII/XhoI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+), содержащего терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, сайт инициации репликации и ген -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pE-His8-TrxL-Ar2 клеток Escherichia coli к ампициллину, в качестве генетического маркера. Получают штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 – продуцента гибридного белка, содержащего антимикробный пептид ареницин. Изобретение позволяет эффективно получать гибридный белок, содержащий антимикробный пептид ареницин. 2 н.п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии, генной и белковой инженерии и может быть использовано в медицине и в фармацевтической промышленности.

Ареницин является эндогенным антибиотиком беспозвоночного Arenicola marina (пескожил морской), относящегося к классу Polychaeta (многощетинковые) типа Annelida (кольчатые черви) [пат. РФ № 2261866, С07К 14/435, А61Р 31/04, 2005]. Молекула ареницина представляет собой немодифицированную пептидную цепь, содержащую 21 аминокислотный остаток и стабилизированную одной дисульфидной связью, замыкающей цикл из 18 аминокислотных остатков. Ареницин вырабатывается целомоцитами (фагоцитирующими клетками целома червя) и обладает антибактериальной и противогрибковой активностью. Механизм действия ареницина предположительно состоит в избирательном нарушении барьерной функции клеточных мембран патогенных микроорганизмов, не затрагивающем мембраны клеток организма-хозяина. Ареницин является представителем принципиально нового семейства антимикробных пептидов и может найти применение в качестве антибиотика широкого спектра действия для купирования общих и местных инфекционных процессов различной этиологии, дезинфекции хирургических инструментов, зондов, протезов.

Ввиду сравнительно низкого содержания ареницина в природном источнике масштабные структурно-функциональные исследования и клинические испытания этого вещества целесообразно проводить с использованием искусственных аналогов, получаемых методами химического синтеза или рекомбинантной экспрессии. Вследствие достаточно большой протяженности пептидной цепи химический синтез ареницина оказывается дорогостоящим и не может рассматриваться в качестве основы для масштабирования производства. Трудности генно-инженерного подхода, в свою очередь, обусловлены цитотоксичностью ареницина, которая требует обязательной нейтрализации для достижения удовлетворительного уровня экспрессии. В большинстве созданных ранее систем рекомбинантной экспрессии других антимикробных пептидов эта задача решалась, в первую очередь, путем конструирования менее токсичных гибридных белков. Однако задача создания подобной системы для рекомбинантной экспрессии ареницина ранее решена не была.

Изобретение решает задачу конструирования плазмиды, детерминирующей синтез рекомбинантного пептида в составе гибридного белка, и создания высокопродуктивного штамма-продуцента, позволяющего получать гибридный белок His8-TrxL-Ar2 с высоким выходом.

Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pE-His8-TrxL-Ar2 размером 4059 п.о., кодирующей гибридный белок His8-TrxL-Ar2, содержащий антимикробный пептид ареницин, состоящей из BglII/XhoI-фрагмента ДНК (фиг.1), содержащего промотор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, участок связывания рибосомы и последовательность гибридного полипептида His8-TrxL-Ar2, содержащего гистидиновый октамер, модифицированный тиоредоксин A (M37L) и ареницин, и BglII/XhoI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+), содержащего терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, сайт инициации репликации и ген -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pE-His8-TrxL-Ar2 клеток Escherichia coli к ампициллину, в качестве генетического маркера, а также за счет создания штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 – продуцента гибридного белка, содержащего антимикробный пептид ареницин.

Преимущество предлагаемого изобретения заключается, во-первых, в использовании при химико-ферментативном синтезе гена ареницина набора кодонов, являющихся оптимальными для продукции белка в Escherichia coli. На фиг.1 приведена аминокислотная последовательность гибридного белка His8-TrxL-Ar2, содержащего ареницин, и соответствующая ей нуклеотидная последовательность гена. Введение остатка метионина непосредственно перед N-концевым остатком рекомбинантного ареницина обеспечивает возможность избирательного химического расщепления полипептидной цепи бромцианом с высвобождением целевого пептида, не содержащего каких-либо дополнительных аминокислотных остатков по сравнению с природным ареницином. Использование тиоредоксина А в качестве партнера для рекомбинантной экспрессии позволяет нейтрализовать токсичность антимикробного пептида для штамма-продуцента и благодаря этому достичь высоких выходов гибридного белка. Преимущество замены лейцином остатка метионина в положении 37 природного тиоредоксина А, а также использования плазмиды рЕТ20b(+) в качестве основы для создания pE-His8-TrxL-Ar2 состоит в уменьшении числа индивидуальных фрагментов, получаемых в результате расщепления гибридного белка бромцианом в кислой среде, что, в свою очередь, облегчает дальнейшую очистку целевого пептида. Расщепление гибридного белка His8-TrxL-Ar2 бромцианом дает всего один побочный продукт, значительно отличающийся по молекулярной массе и физико-химическим свойствам от целевого пептида, что облегчает решение задачи по его выделению. Наличие гистидинового октамера на N-конце экспрессируемой последовательности обеспечивает возможность аффинной очистки гибридного белка His8-TrxL-Ar2 методом металло-хелатной хроматографии. Для биосинтеза рекомбинантного белка применяются оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию: Т7-1ас промотор для предотвращения базальной экспрессии гена до момента начала индукции и высокого уровня транскрипции соответствующей мРНК при индукции, высокоэффективный терминатор транскрипции фага Т7, и блок стоп-кодонов, исключающих биосинтез удлиненных вариантов рекомбинантного ареницина. Преимущества предлагаемого штамма E.coli BL21(DE3) заключаются в использовании бактерий с фенотипом Lon OmpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого de novo рекомбинантного белка и загрязнения препарата наиболее активными протеазами Е.coli. В хромосомную ДНК BL21(DE3) интегрирован ген Т7-РНК полимеразы, что совместно с использованием Т7-lac промотора и Т7 терминатора в плазмиде pE-His8-TrxL-Ar2 обеспечивает быструю и эффективную продукцию белка клетками E.coli при индукции изопропилтио--D-галактозидом или лактозой.

Конструирование нового гена, кодирующего гибридный белок His8-TrxL-Ar2, осуществляют на основе плазмиды рЕТ20b(+). Искусственный ген, кодирующий гистидиновый октамер, модифицированный тиоредоксин A (M37L) и ареницин, фланкированный сайтами рестриктаз BglII и XhoI, получают химическим синтезом набора олигонуклеотидных фрагментов с последующей их сборкой и амплификацией при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Перед легированием для получения липких концов амплификат и векторную плазмиду обрабатывают рестриктазами BglII и XhoI. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток E.coli DH10B. Отбор положительных клонов проводят при помощи ПЦР с использованием специфических праймеров и последующим рестриктным анализом выделенной плазмидной ДНК. Структуру гена, кодирующего гибридный белок, содержащий ареницин, определяют секвенированием по методу Сэнгера.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pE-His8-TrxL-Ar2, кодирующая гибридный белок His8-TrxL-Ar2, содержащий антимикробный пептид ареницин, характеризуется следующими признаками:

– имеет размер молекулы 4059 п.о.;

– кодирует гибридный белок His8-TrxL-Ar2, содержащий гистидиновый октамер, модифицированный тиоредоксин А (M37L) E.coli и ареницин;

– состоит из: BglII/XhoI-фрагмента ДНК, содержащего промотор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, участок связывания рибосомы и последовательность гибридного полипептида His8-TrxL-Ar2, содержащего гистидиновый октамер, модифицированный тиоредоксин А (M37L) и ареницин, и BglII/XhoI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+), содержащего терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, сайт инициации репликации и ген -лактамазы;

– имеет уникальную совокупность признаков: промотор и терминатор транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7; сайт связывания рибосомы; искусственный ген, кодирующий гибридный белок His8-TrxL-Ar2, содержащий гистидиновый октамер, модифицированный тиоредоксин A (M37L) и ареницин; ген -лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой pE-His8-TrxL-Ar2.

Для получения штамма-продуцента гибридного белка His8-TrxL-Ar2 препаратом плазмидной ДНК pE-His8-TrxL-Ar2 трансформируют компетентные клетки Escherichia coli BL21(DE3) и проводят отбор клонов, обладающих способностью экспрессировать рекомбинантный белок. Уровень экспрессии рекомбинантных белков контролируют с помощью денатурирующего ПААГ-электрофореза.

Полученный штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие, серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или YT-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки: клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам: клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 500 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена -лактамазы (bla).

Преимущества предлагаемого штамма-продуцента заключаются в использовании бактерий с фенотипом Lon OmpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого de novo рекомбинантного белка и загрязнения препарата наиболее активными протеазами Е.coli. В хромосомную ДНК BL21(DE3) интегрирован ген Т7-РНК полимеразы, что совместно с использованием Т7-lac промотора и Т7 терминатора в плазмиде pE-His8-TrxL-Ar2 обеспечивает быструю и эффективную продукцию белка клетками E.coli при индукции изопропилтио--D-галактозидом или лактозой.

Клетки E.coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 являются суперпродуцентом. При индукции изопропилтио--D-галактозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка His8-TrxL-Ar2, содержащего ареницин, который накапливается в клетках в количестве 20-25% от суммарного белка бактерии.

На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность BglII/XhoI-фрагмента ДНК, содержащего промотор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, участок связывания рибосомы и последовательность гибридного полипептида His8-TrxL-Ar2; приведена соответствующая аминокислотная последовательность His8-TrxL-Ar2; показаны природные нуклеотидные и аминокислотные последовательности тиоредоксина A E.coli и ареницина-2 A.marina. На фиг.2 представлена физическая карта плазмиды pE-His8-TrxL-Ar2.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1.

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pE-His8-TrxL-Ar2.

Нуклеотидную последовательность, соответствующую гену His8-TrxL-Ar2, получают химико-ферментативным синтезом. Химический синтез олигонуклеотидов, используемых для сборки нуклеотидной последовательности, выполняют твердофазным фосфоамидитным методом с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3-конца к 5-концу с помощью защищенных фосфамидитов – 5-диметокситритил-N-ацил-2-дезоксинуклеозид-3-O-(-цианэтилдиизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Фрагмент, кодирующий модифицированный тиоредоксин A (M37L) получают методом ПЦР-амплификации и направленного мутагенеза с помощью ген-специфических праймеров, используя в качестве исходной матрицы ген тиоредоксина A E.coli. Остальные участки последовательности получают путем последовательного отжига и элонгации взаимно перекрывающихся олигонуклеотидов. На завершающей стадии синтеза последовательность амплифицируют с помощью праймеров, несущих на 5-концах сайты узнавания рестриктаз BglII и XhoI. Продукт амплификации гидролизуют указанными рестриктазами, очищают электрофорезом в 1,5% агарозном геле, полосу ДНК величиной около 570 п.о. выделяют из геля методом электроэлюции в 15% раствор ПЭГ-6000 и используют в лигазной реакции с фрагментом ДНК размером около 3,5 тыс.п.о., полученным в результате обработки плазмиды рЕТ20b(+) рестриктазами BglII и XhoI. В результате лигазной реакции образуется кольцевая ковалентно замкнутая ДНК размером 4059 п.о. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток E.coli DH-10B, приготовленных по стандартному протоколу с помощью 0,1 М хлорида кальция. После трансформации суспензию бактерий смешивают с питательной средой LB, растят 1 ч при 37°С и высевают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина.

Первичный отбор клонов, содержащих нужную плазмиду, осуществляют методом “ПЦР с клонов”. Отобранные клоны используют для подращивания в жидкой среде и выделения плазмидной ДНК, которую анализируют на наличие вставки с помощью рестриктного анализа. Окончательное строение плазмид, содержащих требуемый фрагмент, подтверждают определением нуклеотидной последовательности секвенированием по Сэнгеру. По данным секвенирования отбирают ту плазмиду, у которой нуклеотидная последовательность легированной вставки полностью идентична первоначально запланированной (фиг.1).

Пример 2.

Получение штамма-продуцента E.coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2, вырабатывающего рекомбинантный белок His8-TrxL-Ar2, и определение его продуктивности.

Проводят трансформацию клеток E.coli BL21(DE3) плазмидой pE-His8-TrxL-Ar2, как описано в примере 1. Петлей переносят несколько колоний в 10 мл жидкой среды LB, содержащей 150 мкг/мл ампициллина, подращивают до оптической плотности OD₆₀₀ 0,7 на термостатируемой качалке со скоростью вращения 200 мин^-1 при температуре 37°С, отбирают аликвоту культуры для последующего анализа, добавляют индуктор – изопропилтио--D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают инкубацию при температуре 27°С в течение 5 ч, отбирая каждый час пробы по 0,3 мл для определения оптической плотности OD₆₀₀ и последующего электрофоретического анализа. Равные аликвоты суспензии клеток, отобранных до внесения индуктора и после завершения роста, центрифугируют, отделяют супернатант и анализируют осадок клеток ПААГ-электрофорезом в денатурирующих условиях. Для этого образцы лизируют буфером, содержащим 1% SDS, 1% -меркаптоэтанола, 8М мочевину на водяной бане в течение 5 мин. Электрофорез проводят в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают 0,025% кумасси G-250 по стандартной методике. Появление отчетливой полосы в районе 16 кДа в образцах, отобранных после индукции, свидетельствует о способности штамма синтезировать рекомбинантный His8-TrxL-Ar2. Относительное содержание рекомбинантного белка определяют путем сканирования и денситометрического анализа окрашенных гелей.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pE-His8-TrxL-Ar2 размером 4059 п.о., кодирующая гибридный белок His8-TrxL-Ar2, содержащий антимикробный пептид ареницин, состоящая из

BglII/XhoI-фрагмента ДНК, приведенного на фиг.1, содержащего промотор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, участок связывания рибосомы и последовательность гибридного полипептида His8-TrxL-Ar2, содержащего гистидиновый октамер, модифицированный тиоредоксин A (M37L) и ареницин,

BglII/XhoI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+), содержащего терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, сайт инициации репликации и ген -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pE-His8-TrxL-Ar2 клеток Escherichia coli к ампициллину, в качестве генетического маркера.

2. Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 – продуцент гибридного белка, содержащего антимикробный пептид ареницин.

РИСУНКИ