Патент на изобретение №2316336

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ С ПОНИЖЕННОЙ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

(57) Реферат:

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, к биохимии, конкретно к биологически активным пептидам латарцинами, обладающим антимикробным действием, которые могут найти применение в биотехнологии и медицине. Способ получения антимикробных пептидов латарцинов с пониженной гемолитической активностью химическим или биотехнологическим синтезом включает предварительное моделирование пространственной структуры исходного пептида латарцина с высокой гемолитической активностью в -спиральной конформации и замену гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные в процессе синтеза, в ходе которого происходит замена гидрофобных аминокислот Ile⁷ и Phe¹⁰ на гидрофильные Gln⁷ и Lys¹⁰. При этом после моделирования пространственной структуры исходного пептида латарцина в -спиральной конформации дополнительно проводят расчет гидрофобных свойств пептида с учетом молекулярного гидрофобного потенциала в каждой точке поверхности пептида, выявление гидрофобных кластеров и аминокислотных остатков, локализованных в них, с последующим определением наиболее эффективных гидрофильных аминокислотных остатков для использования в процессе синтеза. Способ позволяет получать пептиды со значительно сниженными гемолитическими свойствами, а также понизить цитотоксичность пептидов латарцинов. 3 табл., 2 ил.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”Application of ALOGPS to predict 1-octanol/water distribution coefficients, logP, and logD, of AstraZeneca in-house database”, J Pharm Sci. 2004; 93(12): 3103-10. PMID 15514985. реф. Poroikov V.V. Filimonov D.A. How to acquire new biological activities in old compounds by computer prediction, J Comput Aided Mol Des. 2002; 16(11): 819-24., PMID 12825794.

Изобретение относится к биохимии, конкретно к биологически активным пептидам, обладающим антимикробным действием, которые могут найти применение в биотехнологии и медицине.

-спираль при контакте с мембранами, обсуждаются подходы к оптимизации их свойств с целью повышения терапевтического потенциала [Tossi A., Sandri L., Giangaspero A. Amphipathic,

В числе свойств, которые необходимо контролировать у потенциальных антибиотиков, – цитотоксическое действие на клетки макроорганизма, чаще оцениваемое в стандартных тестах на гемолитическую активность. Наличие подобной активности у целого ряда антимикробных пептидов широкого спектра действия является серьезным недостатком и ограничивает возможность их применения в качестве лекарственных средств. Таким образом, важной задачей является оптимизация свойств пептидов, а именно снижение их гемолитической активности, токсичности в отношении нормальных клеток человека.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения антимикробных пептидов с пониженной гемолитической активностью, включающий замену гидрофобных аминокислотных остатков, локализованных в кластерах гидрофобности [Chen Y. et al. Rational design of -спирали. При таком способе детализации гидрофобных свойств пептида теряется информация о пространственном распределении гидрофобности в аминокислотных остатках, что приводит к невозможности корректной оценки вклада различных остатков пептида в формирование поверхностных гидрофобных паттернов.

Изобретение решает задачу получения антимикробных пептидов с пониженной гемолитической активностью.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения антимикробных пептидов с пониженной гемолитической активностью химическим или биотехнологическим синтезом, включающем моделирование пространственной структуры исходного пептида с высокой гемолитической активностью в -спиральной конформации и замену гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные в процессе синтеза, после моделирования пространственной структуры исходного пептида в -спиральной конформации дополнительно проводят расчет гидрофобных свойств пептида с учетом молекулярного гидрофобного потенциала в каждой точке поверхности пептида, выявление гидрофобных кластеров и аминокислотных остатков, локализованных в них, с последующим определением наиболее эффективных гидрофильных аминокислотных остатков для использования в процессе синтеза.

Способ осуществляют следующим образом:

1. моделируют пространственную структуру исходного пептида с высокой гемолитической активностью в -спиральной конформации,

2. рассчитывают молекулярный гидрофобный потенциал (МГП) для каждой точки поверхности пептида,

3. проецируют полученные значения МГП на поверхность цилиндра, аппроксимирующего -спираль, и картируют эти значения на плоскости (; Z), где – угол поворота, Z – смещение вдоль оси -спирали,

4. выявляют гидрофобные паттерны (кластеры) на полученной плоскости и аминокислотные остатки, локализованные в них,

5. определяют наиболее эффективные гидрофильные аминокислотные остатки для замены идентифицированных гидрофобных аминокислотных остатков с целью сокращения гидрофобных кластеров,

6. проводят химический или биотехнологический синтез пептида с введением в его аминокислотную последовательность эффективных гидрофильных остатков.

В предлагаемом способе анализ пространственной организации гидрофобных свойств АМП основан на расчете МГП для каждой точки поверхности пептида в конформации идеальной

Применение заявляемого способа позволяет значительно снизить гемолитическую активность пептидов (в десятки раз увеличить необходимую для лизиса эритроцитов концентрацию), а также цитотоксичность в отношении других клеток человека при сохранении высокой антимикробной активности.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Расчет карты гидрофобной поверхности линейного антимикробного пептида.

Для исходного гемолитически активного пептида (LtAMP-2a) проводят моделирование пространственной структуры в

Здесь f_k – атомная константа гидрофобности атома k, принадлежащего остатку i, R_jk – расстояние между атомом k и точкой j (в Å), N_i – число атомов в остатке i, с=1 Å^-1. Значения атомных констант гидрофобности (f_k, Z) ( – угол вращения относительно оси спирали, Z – смещение вдоль оси спирали) представляют с помощью контурных линий, соединяющих точки с одинаковым потенциалом. Для этого предварительно выполняют сплайн-интерполяцию данных (_i, Z_i) для получения набора значений (‘_i,Z’_i

Пример 2.

Выбор аминокислотных замен для получения аналогов антимикробного пептида со сниженной гемолитической активностью.

На построенной двумерной карте гидрофобности (см. пример 1, фиг.1Б) исходного гемолитически активного пептида (LtAMP-2а) находят протяженные паттерны гидрофобности. Определяют ключевые остатки пептида, формирующие обширные гидрофобные области – Ile⁷, Phe¹⁰ (см. фиг.2). Предлагают замены соответствующих остатков на полярные или заряженные остатки, сходные по размеру и склонности к формированию -спирали: Ile->Gln, Phe->Lys. Аминокислотные последовательности полученных аналогов (LtAMP-2a_I7Q, LtAMP-2a_F10K) приведены в таблице 1.

Для пептидов LtAMP-2a_I7Q и LtAMP-2a_F10K проводят расчет двумерных карт гидрофобности согласно схеме, описанной в примере 1. Полученные карты используют для оценки влияния предложенных мутаций на структуру гидрофобных паттернов на поверхности пептидов. Из фиг.2 видно, что предложенная замена в случае пептида LtAMP-2a_I7Q приводит к уменьшению размера гидрофобной области, соответствующей остатку Gln⁷ по сравнению с исходным пептидом LtAMP-2а. Замена Phe->Lys приводит к разрыву исходного гидрофобного паттерна в области остатка Lys¹⁰.

Пример 3.

Химический синтез пептидов.

Пептид LtAMP-2a синтезируют твердофазным методом путем наращивания цепи с С-концевого остатка на 2-хлор-тритил-хлоридной (с нагрузкой 0,8-1,44 ммоль/г) смоле (PepChem, Германия) для временной защиты -NH₂-групп используют флуоренилметоксикарбонильную группу (Fmoc) [Chan W.C., White P.D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. – 2000. – University Press, Oxford]. Защиту боковых групп аминокислотных остатков выбирают с расчетом на конечное деблокирование трифторуксусной кислотой: для защиты боковых групп остатков Ser и Tyr используют третбутильную группу, для Lys – третбутилоксикарбонильную группу, для His – тритильную группу, для Arg – 2,2,4,6,7-пентаметилдегидробензофуран-5-сульфонильную группу.

Для присоединения первой (С-концевой) аминокислоты к смоле 1,5 экв (по отношению к количеству активных групп на смоле) Fmoc-защищенной аминокислоты растворяют в дихлорметане (из расчета 10 мл дихлорметана на 1 г смолы) с 1,5 экв диизопропилэтиламина.

К полученному раствору добавляют еще 1,5 экв диизопропилэтиламина и приливают к сухой смоле, мягко перемешивают в течение 45 мин. Непрореагировавшие активные группы на смоле блокируют метанолом (из расчета 1 мл метанола на 1 г смолы) в течение 20 мин, после чего смолу промывают тремя объемами дихлорметана, тремя объемами N,N-диметилформамида и тремя объемами этанола, высушивают под вакуумом. Аминокислотные остатки присоединяют к пептидил-полимеру с образованием гидроксибензотриазолового эфира в присутствии 1,3-диизопропилкарбодиимида, для активации 1 экв аминокислоты используют 1,2 экв N-гидроксибензотриазола и 1 экв 1,3-диизопропилкарбодиимида. Для наращивания полипептидной цепи в ходе каждого синтетического цикла проводят конденсацию пептидил-полимера с 5 экв активированной Fmoc-аминокислоты (1-12 часов при 37°С), содержание непрореагировавших аминогрупп контролируют визуально по окрашиванию рН-зависимого индикатора бромфенолового синего.

Отщепление продукта от 2-хлор-тритил-хлоридного полимера с одновременным деблокированием боковых групп проводят смесью трифторуксусной кислоты, воды и этандитиола (95:2,5:2,5, v/v/v) из расчета 1 мл смеси на 50 мг смолы. Суспензию перемешивают в течение 2 часов, затем раствор пептида в трифторуксусной кислоте отфильтровывают от полимера. Продукт высаживают 10-кратным избытком (по объему) охлажденного диэтилового эфира, отфильтровывают, дважды промывают эфиром, после чего высушивают лиофильно.

Синтезированный пептид подвергают очистке по методу ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой Luna C₁₈ (10×250 мм, размер пор 100 Å, диаметр частиц 10 мкм, Phenomenex, США). Фракционирование проводят в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 0 до 50% (v/v) в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте в течение 60 минут со скоростью элюции 2 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм.

Содержание примесей в синтетическом препарате LtAMP-2a составляет 1%, что подтверждается разделением по методу ВЭЖХ на аналитической колонке Luna C₁₈ (1×150 мм, размер пор 100 Å, диаметр частиц 3 мкм, Phenomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 20 до 50% (v/v) в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте в течение 40 минут со скоростью элюции 50 мкл/мин, детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм.

Идентичность синтезированного LtAMP-2a природному доказывают при помощи масс-спектрометрического анализа, сравнением хроматографических подвижностей при разделении на аналитической колонке Luna C₁₈ (1×150 мм, Phenomenex, США), а также сравнением биологических свойств.

Пептиды LtAMP-2a_F10K и LtAMP-2a_I7Q синтезируют аналогичным способом, внося необходимые аминокислоты. Для защиты боковой цепи Gln используют тритильную группу.

Пример 4.

Тестирование пептидов на антимикробную активность.

^th ed. – Williams and Wilkins, Baltimore. – 1996. – P.52-111].

Бактерии культивируют в жидкой низкосолевой среде LB (1% бакто-триптон, 0,5% бакто-дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, pH 7) при 37°С и перемешивании со скоростью 220 об/мин в течение 18 ч. Полученные культуры разбавляют в 200 раз, используя среду LB, и выращивают в тех же условиях в течение 3-5 ч до достижения экспоненциальной фазы роста (оптическая плотность культуры при 620 нм OD₆₂₀˜0,3-0,5), после чего снова разбавляют до концентрации клеток 10⁵ колоний образующих единиц в 1 мл. Культуры помещают в стерильные 96-луночные планшеты, по 90 мкл в лунку, куда затем добавляют по 10 мкл растворов тестируемых веществ различных концентраций, получаемых серийными разведениями. Отрицательным контролем служит культура клеток с добавлением 10 мкл чистой воды, положительным – чистая среда для культивирования. Планшеты инкубируют в условиях, описанных выше, в течение 24 ч, после чего измеряют OD₆₂₀, минимальные ингибирующие концентрации определяют как наименьшие концентрации веществ, полностью подавляющие рост микроорганизмов. Опыт проводят в трех независимых повторах.

Результаты определения минимальных ингибирующих концентраций для пептидов LtAMP-2a, LtAMP-2a_F10K, LtAMP-2a_I7Q представлены в таблице 2. Пептиды LtAMP-2a_F10K и LtAMP-2a_I7Q сохраняют высокую антимикробную активность.

Пример 5.

Тестирование пептидов на гемолитическую активность.

Гемолитическую активность пептидов определяют с использованием крови здорового донора (группа В, Rh+). К 100 мкл свежей крови добавляют 900 мкл среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамин, 8% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС) и гепарин (10 ед/мл). Определяют плотность клеток, после чего суспензию разводят средой RPMI-1640 до плотности 10⁷ клеток/мл. К полученной суспензии добавляют тестируемый пептид нужной концентрации, в качестве отрицательного контроля используют клетки без добавления пептида. Инкубируют при 37°С и перемешивании со скоростью 120 об/мин в течение 3 ч, после чего клетки осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 4000 g, 100 мкл супернатанта отбирают в стерильные 96-луночные планшеты, выход гемоглобина из эритроцитов оценивают по оптической плотности при 414 нм. Гемолитическая активность пептидов (см. табл. 3) выражается в % от максимально возможного гемолиза, максимально возможный лизис эритроцитов (положительный контроль) получают за счет ресуспендирования осажденных клеток в чистой воде до плотности 10⁷ клеток/мл.

В результате получают, что предложенные аналоги LtAMP-2a_F10K и LtAMP-2a_I7Q для исходного гемолитически активного пептида подобной активности не проявляют (0% гемолиз) в концентрациях до 45 мкМ.

Пример 6.

Тестирование пептидов на цитотоксичность по отношению к лейкоцитам и клеткам эритролейкемии человека.

Оценку цитотоксических свойств латарцинов для лейкоцитов человека проводят на фракции крови здорового донора (группа В, Rh+), обогащенной лейкоцитами, которую получают отстаиванием гепаринизированной (10 ед/мл) крови в течение 2 ч при 15°С в темноте. Отбирают фракцию выше эритроцитарного столба, соотношение лейкоцитов и эритроцитов в которой 1:10, добавляют 1,5 объема среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамин и 8% ЭБС. Клетки осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 200 g, супернатант удаляют, клетки ресуспендируют в равном объеме среды RPMI-1640. Операцию повторяют дважды, после чего клетки рассаживают в 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты (10⁶ клеток/мл, 150 мкл среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-GIn и 8% ЭБС, на лунку).

Клетки эритролейкемии человека К562 культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 8% ЭБС при 37°С, в атмосфере 100%-ной влажности с 5%-ным содержанием СО₂. За день до эксперимента клетки рассаживают в 96-луночные планшеты (10⁶ клеток/мл).

В лунки вносят исследуемые пептиды в нужной концентрации, в качестве отрицательного контроля в лунки добавляют чистую воду. Клетки (К562 и лейкоциты) инкубируют с различными концентрациями пептидов в течение 3 ч при 37°С, затем в лунки вносят флуоресцентные красители Hoechst33342 (20 мкМ, окрашивает ядра всех клеток) и пропидиум иодид (20 мкМ, окрашивает ядра мертвых клеток) и через 15 мин регистрируют флуоресцентные изображения клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200M (Zeiss, Германия) с цифровой камерой AxioCam MRc (Zeiss, Германия) в области флуоресценции Hoechst33342 (фильтры на возбуждение – ВР 365/12, на эмиссию – LP 397) и в области флуоресценции пропидиум иодида (фильтры на возбуждение – ВР 510-560, на эмиссию – LP 590). По этим изображениям для каждой концентрации пептида подсчитывают общее число клеток (1000 клеток на одно измерение) и число мертвых клеток среди них, а затем рассчитывают концентрацию пептида, вызывающую гибель 50% клеток, ИК₅₀. Результаты (см. табл. 3) усредняют по трем независимым экспериментам.

В итоге получают, что предложенные аналоги LtAMP-2a_F10K и LtAMP-2a_I7Q для исходного цитотоксичного в отношении нормальных лейкоцитов пептида подобной активности не проявляют (0% лизис) в концентрациях до 45 мкМ. Однако пептиды сохраняют достаточно высокую цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток.

Таблица 3 Цитотоксические свойства исходного пептида LtAMP-2a и его аналогов
пептид	эритроциты человека	нормальные лейкоциты человека	клетки эритролейкемии человека К562
	ЭК50 , мкМ	ИК50 , мкМ	ИК50 , мкМ
LtAMP-2a (исходный)	9,2	17,9	3,3
LtAMP-2a_F10K	–	–	18,6
LtAMP-2a_I7Q	–	–	24,7
– эффективная концентрация, вызывающая 50%-ный лизис – активность отсутствует (0% лизис) при концентрациях до 45 мкМ

Формула изобретения

Способ получения антимикробных пептидов с пониженной гемолитической активностью, включающий моделирование пространственной структуры исходного пептида с высокой гемолитической активностью в -спиральной конформации и химический синтез с заменой гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные в процессе синтеза, отличающийся тем, что после моделирования пространственной структуры исходного пептида в -спиральной конформации дополнительно проводят расчет гидрофобных свойств пептида с учетом молекулярного гидрофобного потенциала в каждой точке поверхности пептида, выявление гидрофобных кластеров и аминокислотных остатков, локализованных в них, с последующим определением наиболее эффективных гидрофильных аминокислотных остатков, являющихся полярными или заряженными, сходными по размеру и склонности к формированию -спирали, для использования в процессе синтеза, в ходе которого происходит замена гидрофобных аминокислот Ile⁷ и Phe¹⁰ на гидрофильные Gln⁷ и Lys¹⁰.

РИСУНКИ