Патент на изобретение №2159624

(54) СРЕДСТВО ДЛЯ КОРРЕКЦИИ МИКРОБИОЦЕНОЗА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к фармакологии, в частности к пробиотикам, и может быть использовано при коррекции микробиоценоза организма человека (детей и взрослых) и животных. Изобретение характеризуется тем, что создано средство, корректирующее микробиоценоз путем сочетания компонентов, входящих в его состав, и защиты его биологически активной части от воздействия среды желудка и кишечника, в результате чего достигается повышение фармакологических свойств средства и его клеточно-биологической активности. Средство представляет собой выполненные из фармацевтически приемлемого полисахарида микрокапсулы диаметром, не превышающим 100 мкм, в каждой из которых размещен приемлемый сорбент с размером частиц 10-100 мкм с нанесенными на них не менее 12 клетками аутохтонных штаммов микроорганизмов. Средство обеспечивает защиту от воздействия среды кишечника и желудка. 4 з.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно – к фармакологии, в частности к пробиотикам, и может быть использовано при коррекции микробиоценоза организма человека (детей и взрослых) и животных.

В настоящее время микробные экологические системы человека представлены как своеобразный орган, играющий важную роль в обеспечении иммуностимулирующей, витаминообразующей, ферментной функций организма. Кроме того, нормальная микрофлора принимает участие в регуляции содержания холестерина в крови, нормализации кровяного давления и имеет антимутагенное, антиканцерогенное и противоинфекционное действие. Среди представителей нормальной микрофлоры кишечника преобладает род Bifidobakterium, который состоит из 24 видов. Существует обоснованное мнение, что бифидобактерии, находящиеся в слизистой оболочке не только кишечника, но и, например, влагалища у женщин, играют решающую роль в процессах коррекции микробиоценоза. Среди патологий кишечника значительное место отводится дисбактериозам, которые обусловлены отсутствием или снижением уровня бифидобактерии, наличием кишечных палочек с измененными ферментативными свойствами, а также присутствием в кишечнике шигелл, сальмонелл, энтеропатогенных кишечных палочек, протеев, энтеробактеров, цитробактеров, синегнойных палочек, стафилококков.

В настоящее время существует ряд препаратов, направленных на коррекцию микробиоценоза кишечника установленной этиологии, например колибактерин (ФС 42-253 ВС-89), но известное средство не обеспечивает в должной степени антагонистичной противоинфекционной активности и необходимого уровня приживляемости микроорганизмов на тканях, и кроме того, оно имеет относительно низкую биодоступность.

Наиболее близким к заявляемому решению является средство, корректирующее дисбактериоз различной этиологии и представляющее собой активированый уголь, на поверхность которого нанесены клетки аутохтонных штаммов в количестве 2,110³-1,010⁵ на 1 мм², а частицы активированного угля имеют размер меньше 30 мкм (патент РФ N 2017486).

Хотя антиинфекционная активность и приживляемость аутохтонных микроорганизмов характеризуется относительно высокими показателями, известное средство имеет ряд недостатков. В первую очередь, из-за механической незащищенности средства при его употреблении имеет место элюция микробных клеток (МК) уже в верхних отделах кишечника, что и является причиной, уменьшающей его эффективность.

Кроме того, иммобилизованные на поверхности активированного угля микробные клетки подвергаются вредному воздействию желудочного сока и частично гибнут, что также снижает эффективность известного средства.

И, наконец, еще одним недостатком средства-прототипа является его низкая сохраняемость при обычных условиях из-за недостаточной выживаемости микробных клеток. Средство сохраняется при 4-8^oC на протяжении года.

Задачей настоящего изобретения является создание средства, корректирующего микробиоценоз, путем сочетания компонентов, входящих в его состав, и защиты его биологически активной части от воздействия среды желудка и кишечника, в результате чего достигается повышение фармакологических свойств средства и его клеточно-биологической активности.

Поставленная задача решается тем, что средство для коррекции микробиоценоза содержит в себе сорбент с нанесенными на него клетками аутохтонных штаммов микроорганизмов, согласно изобретению, представляет собой выполненные из фармацевтично приемлемого и полисахарида микрокапсулы с диаметром, не превышающим 100 мкм, в каждой из которых замещен приемлемый сорбенте размером частиц 10-100 мкм, с нанесенными на них не менее 12 клетками аутохтонных штаммов микроорганизмов.

Аутохтонными микроорганизмами являются микроорганизмы-представители нормальной микрофлоры человека или животного (бифидобактерии, энтерококки, лактобациллы, кишечные палочки и др.), которые относятся к роду Bifidobakterium, Lactobacillus, Escherichia, Streptococcus и др.

К приемлемым сорбентам относятся сорбенты, разрешенные Министерством здравоохранения Украины и имеющие следующие свойства:
а) сорбировать на своей поверхности микробные клетки аутохтонных микроорганизмов в количестве не менее 1,810³ микробных клеток на 1 мм² доступной для них поверхности,
б) не разрушать микробные клетки аутохтонных микроорганизмов,
в) иметь способность находиться в порошкообразной форме и иметь размер частиц от 10 до 100 мкм, при этом структура сорбента не должна изменяться под воздействием воды.

Сорбентами, обладающими вышеотмеченными свойствами, могут быть, например, алюмосиликаты, активированный уголь и др.

Авторами настоящего изобретения предложена концентрация клеток аутохтонных штаммов микроорганизмов на 1 мм² поверхности сорбента не менее 1,810³, поскольку такая концентрация определяет необходимую приживляемость аутохтонных микроорганизмов на слизистой оболочке, например, желудка, что в свою очередь, является одним из решающих факторов эффективности лечения посредством заявляемого средства. Концентрацией, рекомендуемой для достижения наиболее высоких результатов, целесообразно считать 2,010⁷ – 1,010⁸ МК/мм².

При попадании капсулы в поле аппликации под воздействием ферментов желудочного сока происходит ее раскрытие. Для раскрытия капсулы необходимо, чтобы она была выполнена из соответствующего материала. Таким материалом может быть приемлем для указанных целей полисахарид, имеющий соответствующие относительно слизистой, например желудка, адгезионные свойства.

Авторы считают, что производные целлюлозы являются наиболее подходящими с точки зрения наличия указанного свойства, технологичности и экологичности.

Кроме того, указанные свойства материала микрокапсул усиливаются при их дополнительном покрытии каррагинаном и/или альбумином.

Защита активной части средства, а именно сорбента с иммобилизованными на нем клетками микроорганизмов, позволяет капсуле раскрыться, например, в желудке, где и необходимо ее действие на слизистую за счет трех процессов, проходящих параллельно: адгезионной активности раскрывшейся капсулы, адгезионной активности сорбента и микробных клеток. Совокупность этих процессов дает наиболее высокий результат при условии, что размер частиц сорбента будет находиться в диапазоне 10-100 мкм, а количество клеток будет не менее 12. Размер самой капсулы, а именно ее диаметр, не должен превышать 100 мкм.

Для определения оптимальных размеров частиц сорбента в заявляемом средстве готовили суспензии активированного угля с преобладающим размером частиц от 5 до 100 мкм, создавали на их поверхности одинаковую концентрацию 1,010⁶ МК/мм² (бифидобактерии, лактобациллы) с учетом того, что нижний уровень оптимального насыщения слизистой составляет 1,410⁵ МК/мм².

Суспензии, представляющие собой микроколонии разных размеров (по количеству микробных клеток, сорбированных на одной частице сорбента), одноразово вводили перорально крысам в возрасте 4 недель с таким расчетом, чтобы количество введенных лактобацилл и бифидобактерии отвечало суточной дозе, рекомендованной для человека (3010⁹ мкм) в перерасчете на вес животного. Животные были разделены на две группы. Через 7 ч препарировали кишечники первой группы, а через 24 ч второй. Гомогенаты слизистой высевали на питательной среде и определяли уровень колонизации слизистой. Результаты эксперимента приведены в табл. 1.

Из приведенных в табл. 1 результатов следует, что поддерживающий характер колонизации слизистой, когда микробные клетки, входящие в микроколонии, способны к размножению, наблюдается при использовании частиц сорбента от 10 до 100 мкм. Частицы сорбента размером 100 мкм и выше на поверхности слизистой не задерживаются. Частицы размером 5 мкм и ниже, представляющие собой микроколонии с 5-6 МК, колонизационного действия самостоятельно не производят (необходима их конгломерация в 12-15 штук).

Минимальным уровнем поверхностной концентрации МК аутохтонных микроорганизмов, сорбированных на сорбенте, можно считать 12 – 180 МК, размещенных на частице размером 10 – 20 мкм с поверхностью 6,0 10² мкм² (0,0006 – 0,0024 мм²). Соответственно минимальный уровень поверхностной концентрации в препарате составляет 2,0 10³ – 7,5 10⁴ МК аутохтонных микроорганизмов на 1 мм² сорбента.

Из этой же таблицы становится ясно, что минимальный размер микроколонии должен быть не ниже 120-180 МК аутохтонных микроорганизмов, сконцентрированных на одной или нескольких частицах сорбента с общей проекцией площади на поверхность слизистой не более 0,00024 мм².

С целью обоснования максимального уровня поверхностной концентрации МК аутохтонных микроорганизмов на поверхности сорбента, бифидобактерии сорбировали на поверхности порошкообразного активированного угля с таким расчетом, чтобы получить препараты, имеющие концентрацию МК от 10² до 10⁸ МК/мм² на единицу поверхности сорбента. При этом учитывали, что препараты, имеющие поверхностную концентрацию выше 4 10⁶ МК/мм² содержат в себе больше одного мультислоя клеток.

Затем одинаковые аликвоты сорбента вводили перорально крысам и через 3 часа препарировали кишечники. Гомогенаты рассевали на питательные среды. Учитывали уровень адгезии бифидобактерии на единицу поверхности слизистой в зависимости от поверхностной концентрации МК на сорбенте.

Результаты исследований приведены в табл. 2.

Данные табл. 2 свидетельствуют, что максимальный уровень поверхностной концентрации, целесообразной при конструировании препарата, составляет 10⁷ – 10⁸ МК/мм² сорбента.

Далее насыщение слизистой при увеличении поверхностной концентрации МК на сорбенте практически не увеличивается.

Изобретение поясняется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Заявляемое средство получают в два этапа. Сначала клетки микроорганизмов сорбируют на частицах сорбента, способного создать на своей поверхности поверхностную концентрацию не менее 1,810³ МК аугохтонных микроорганизмов на 1 мм² поверхности.

Полученную суспензию перемешивают на протяжении 20-40 мин. После чего суспензию смешивают с капсулообразующими веществами, являющимися производными целлюлозы, которые могут быть покрыты каррагеном или альбумином в соотношении: на 4 ч. суспензии 0,5-1,0 ч. капсулообразующего вещества, и распыляют полученную смесь через фильеры с таким расчетом, чтобы получить микрокапсулы размером от 10 до 100 мкм в диаметре.

Распыление проводят таким образом, чтобы температурный режим и pH среды не повлияли на жизнеспособность микроорганизмов (pH 7,0-7,3, температура не выше 22 – 26^oC).

Микрокапсулы, которые содержат в середине частицы сорбента с сорбированными на них аугохтонными микроорганизмами, поместили в лотки и подвергли лиофильной сушке при заданном режиме (длительность сушки – 72 ч, охлаждение при температуре не ниже – 45^oC, нагрев при температуре не выше 24-26^oC, поверхностный слой материала не больше 1,0-1,5 см).

Полученный препарат представляет собой порошок, каждая частица которого создает микроколонию аугохтонных микроорганизмов. Микроколония состоит из микробных клеток (не меньше 12-180), сорбированных на одной или нескольких частицах сорбционного материала. Увеличение количества клеток в микроколонии не влияет на качество и эффективность препарата.

Фармакологическое действие заявляемого средства обусловлено следующими факторами:
а) сохранением клеток микроорганизмов при прохождении через желудок,
б) адгезией микроколонии на слизистой в поле апликации,
в) частичного растворения микрокапсулы и освобождения частиц сорбента с нанесенными на него микробными клетками аутохтонных микроорганизмов,
г) последующей адгезией частиц сорбента с нанесенными на них микробными клетками на слизистой поверхности,
д) колонизацией слизистой поверхности кишечника,
е) количеством введенных в организм микроколоний (не менее 10⁴ – 10⁵).

Пример 2. При определении клинико-бактериологической активности заявляемого средства, представляющего собой капсулу, выполненную из производных целлюлозы и покрытую альбумином, в которой размещены частицы активированного угля (размер частиц от 5 до 80 мкм), в качестве аутохтонных микроорганизмов использовали бифидобактерии, нанесенные на приведенные выше частицы активированного угля в количестве не менее 12 клеток.

В качестве сравнения использовали бифидобактерии. Препараты вводили перорально добровольцам-носителям условно-патогенных микроорганизмов. Полученные результаты представлены в табл. 3.

Данные табл. 3 свидетельствуют о следующем:
а) клинико-бактериологическая эффективность, которая состоит в увеличении (нормализации) уровня бифидобактерии и элиминации из организма УПМ, прослеживалась при минимальном введении 3,010⁴ микроколоний,
б) в клинико-бактериологическом плане эффективность иммобилизованного микрокапсулированного препарата выше по сравнению с коммерческим аналогом бифидумбактерином.

Пример 3. Для определения фармакологического качества микрокапсулированного препарата по сравнению с коммерческими препаратами бифидумбактерина и лактобактерина указанные препараты помещали в термостат на сохранение при температуре 37+0,1^oC.

Через один, два и три месяца препараты высевали на соответствующую питательную среду, определяли гибель микробных клеток в процентах от их начального количества. Полученные результаты приведены в табл. 4 и свидетельствуют о том, что сохраняемость предлагаемого средства выше, чем у известных средств.

Таким образом, изобретение позволяет получить препарат-пробиотик, который в результате совокупности его свойств имеет высокое профилактическое и лечебное действие и, кроме того, характеризуется улучшенными условиями хранения.

Формула изобретения

1. Средство для коррекции микробиоценоза, содержащее в себе сорбент с нанесенными на него клетками аутохтонных штаммов микроорганизмов, отличающееся тем, что оно представляет собой выполненные из фармацевтически приемлемого полисахарида микрокапсулы диаметром, не превышающим 100 мкм, в каждой из которых размещен приемлемый сорбент с размером частиц 10-100 мкм с нанесенными на них не менее 12 клетками аутохтонных штаммов микроорганизмов.

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что приемлемый сорбент обладает способностью сорбировать на 1 мм² поверхности не менее 1,8 x 10³ клеток аутохтонных штаммов микроорганизмов.

3. Средство по п.1 или 2, отличающееся тем, что приемлемый сорбент обладает способностью сорбировать на 1 мм² поверхности 2,0 x 10⁷ – 1,0 x 10⁸ клеток аутохтонных штаммов микроорганизмов.

4. Средство по п.1, или 2, или 3, отличающееся тем, что микрокапсулы выполнены из производных целлюлозы.

5. Средство по п.1, или 2, или 3, или 4, отличающееся тем, что микрокапсулы, выполненные из производных целлюлозы, покрыты каррагинаном или альбумином.

РИСУНКИ