Патент на изобретение №2316002

(54) АНАЛИТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ СФИНГОМИЕЛИНАЗЫ И НАБОР, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В ТАКОМ СПОСОБЕ

(57) Реферат:

Настоящее изобретение относится к биохимии и раскрывает аналитический флуориметрический способ и набор обнаружения щелочной сфингомиелиназы (СМазы), включающий сфингомиелин, аналитический буфер при рН 8,9-9,1, содержащий EDTA и EGTA, в количестве, достаточном для ингибирования нейтральной сфингомиелиназы, в-глицерофосфат и АТР, щелочную фосфатазу, холиноксидазу, пероксидазу хрена, реагент Amplex Red, для анализа на присутствие щелочной сфингомиелиназы (СМазы) в биологической жидкости и кале пациента, нуждающегося в таком анализе, поскольку щелочная СМаза является маркером серьезных патологических состояний, таких как рак толстой кишки. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 ил.

Настоящее изобретение относится к аналитическому способу анализа на присутствие щелочной сфингомиелиназы в кале или биологических жидкостях пациентов, нуждающихся в таком анализе. Настоящее изобретение также относится к набору для осуществления указанного аналитического способа.

Более конкретно, способ настоящего изобретения представляет собой флуориметрический способ обнаружения щелочной сфингомиелиназы in vitro, которая, как будет подробно описано ниже, является маркером серьезных патологических состояний, таких как рак толстой кишки и наследственный аденоматозный полипоз.

Фермент сфингомиелиназа (сфингомиелин-фосфодиэстераза, СМаза) катализирует гидролиз сфингомиелина с образованием церамида и холинфосфата.

До настоящего времени было идентифицировано три различных типа СМазы (кислотный, нейтральный и щелочной), которые встречаются в нескольких изоформах, таких как

– лизосомная кислотная СМаза (А-СМаза);

– цитозольная Zn²⁺-зависимая кислотная СМаза;

– мембранная нейтральная магний-зависимая СМаза (N-СМаза):

– цитозольная магний-независимая N-СМаза и

– щелочная СМаза.

Было показано, что СМазы играют определенную роль в физиологических и патологических процессах широкого ряда, включая: лизосомный гидролиз эндоцитозной СМ; опосредованную церамидами передачу клеточного сигнала, атерогенез, терминальную дифференцировку, остановку клеточного цикла, апоптоз, воспаление и регуляцию ответов на стресс у эукариотов.

В отличие от кислотных и нейтральных СМаз, которые обычно присутствуют в клетках в форме лизосомных и мембрано-ассоциированных ферментов, соответственно, щелочная СМаза проявляет тканевую и видовую специфичность. У людей щелочная СМаза присутствует в слизистой кишечника и в желчи. Щелочная СМаза образуется в двенадцатиперстной кишке, достигает высоких уровней в кишечнике, особенно в дистальной части тощей кишки, и присутствует в больших количествах в ободочной кишке и в прямой кишке. Указанная СМаза оптимально действует в щелочной среде при рН 9,0, является Mg²⁺-независимой, зависимой от солей желчных кислот и резистентной к трипсину.

Важная роль щелочной СМазы в патологических процессах была обнаружена лишь недавно, и этот факт явился стимулом для проведения ряда исследований, основанных, главным образом, на следующих соображениях.

Во-первых, фермент может быть ответственным за гидролиз пищевого сфингомиелина, присутствующего, в основном, в молоке, яйцах, мясе и рыбе. Во-вторых, этот фермент может регулировать абсорбцию холестерина. В-третьих, присутствие щелочной СМазы по всему кишечному тракту и селективное снижение ее уровня, обнаруживаемое в колоректальных карциномах, дает основание предполагать, что этот фермент играет определенную роль в кишечном канцерогенезе, так как при определенных физиологических условиях, он стимулирует апоптоз и защищает слизистую кишечника против канцерогенеза.

Проводимые ранее исследования также показали, что при физиологических условиях щелочная СМаза диссоциируется под действием солей желчных кислот из мембраны слизистой кишечника в полость кишечника. Однако, в патологических условиях, когда концентрация солей желчных кислот является аномально повышенной, то диссоциация щелочной СМазы под действием солей желчных кислот может превышать биосинтез фермента, что приводит к низкому уровню активности щелочной СМазы в слизистой и к аномально повышенной экскреции фермента в фекалиях или в биологических жидкостях, то есть в желчи. Следовательно, избыток щелочной СМазы, выделенной в кале или в биологических жидкостях, превышающий нормальные базальные значения, может интерпретироваться как ценный диагностический маркер колоректальной карциномы и наследственного аденоматозного полипоза, а поэтому необходимо разработать надежный анализ для обнаружения щелочной СМазы в кале или в биологических жидкостях пациентов с подозрением на вышеупомянутые патологии кишечного тракта.

Кроме того, некоторые бактериальные штаммы (например, Streptococcus thermophillus Lactobacillus) содержат высокие уровни СМазы, и анализ на щелочную СМазу может обеспечить способ оценки изменений числа указанных бактерий, например, после лечения пробиотическими средствами и/или продуктами на основе пробиотических средств.

Уже известны разработанные ранее методы анализа на щелочную СМазу. Активность СМаз может быть определена либо in vivo с использованием клеток, меченных радиоактивным предшественником СМ, с последующим определением уровней меченого продукта, либо in vitro с использованием радиоактивно меченного СМ или хромогенного аналога СМ или окрашенных и флуоресцентных производных нейтрального СМ.

Эти известные и широко используемые анализы полностью не удовлетворяют современным требованиям, так как они представляют потенциальную опасность, вследствие того, что они являются радиоактивными анализами и, при этом, менее чувствительными, чем флуориметрический анализ.

Целью настоящего изобретения является разработка надежного, недорогостоящего анализа на присутствие щелочной СМазы в кале или в биологических жидкостях пациентов с подозрением на колоректальную карциному и наследственный аденоматозный полипоз или на заболевания желчного пузыря или печени, который преодолеет недостатки известных методов.

Другой целью настоящего изобретения является получение аналитического набора для использования в вышеупомянутом анализе.

Другой целью настоящего изобретения является анализ на бактериальную колонизацию при различных состояниях здоровья или указанных ниже заболеваниях или при лечении лекарственными средствами, или пробиотиками, или пищевыми добавками.

Метод флуориметрического непрямого анализа настоящего изобретения основан на нижеследующей последовательности реакций.

Под действием щелочной СМазы, присутствующей в фекалиях или в других биологических жидкостях, сфингомиелин гидролизуется в церамид и фосфорилхолин, который под действием щелочной фосфатазы гидролизуется с образованием холина. В присутствии холиноксидазы, холин продуцирует пероксид водорода (H₂O₂).

Это последнее соединение, в присутствии пероксидазы хрена, вступает в реакцию с 10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазином, чувствительным флуорогенным зондом для H₂O₂ (называемым далее “реагентом красным Amplex”), в результате чего образуется соединение резоруфин с высокой степенью флуоресценции. Флуоресценцию измеряют с использованием флуориметра для определения интенсивности флуоресценции в микропланшетах при возбуждении флуоресценции при 530-560 нм и детекции флуоресценции при 590 нм.

Аналитический способ настоящего изобретения, основанный на вышеуказанной последовательности реакций с использованием средств для детекции флуоресценции и применяемый для анализа на щелочную СМазу, включает нижеследующие стадии, которые относятся к анализу кала. Однако, для специалиста в данной области очевидно, что этот способ, при соответствующих рутинных модификациях, может быть также с успехом применен и к биологическим жидкостям, таким как желчь. Такими стадиями являются

1) сбор пробы кала пациента и ее сушка;

2) взвешивание примерно 3-4 г высушенной пробы и ее суспендирование в 20 мл гомогенизирующего буфера, содержащего 0,25М сахарозу, 0,15 М KCl, 50 мМ КН₂РО₄, рН 7,4;

3) центрифугирование указанной пробы при 4000 об/мин и при +4°С в течение 60 минут;

4) отделение супернатанта и его повторное центрифугирование в течение 15 минут при 4000 об/мин и при +4°С;

5) определение содержания белка в супернатанте посредством анализа на белок Pierce с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта, где концентрация этого белка для каждой пробы составляет от 32 мг/мл до 40 мг/мл, и пипетирование 25 мкл каждой пробы в лунку;

6) добавление к каждой 25-мкл пробе 65 мкл аналитического буфера, содержащего 50 мМ Трис/HCl, 2 мМ EDTA, 0,15 М NaCl, рН 9,0 и 10 мкл 29 мкМ сфингомиелина и добавление в аналитический буфер солей желчных кислот (ТС, TDC, GC, GCDC) в концентрации 3 мМ;

7) инкубирование при 37°С в течение 1 часа;

8) пипетирование 100 мкл каждого стандарта и 10 мкл сфингомиелина (29 мкМ) с последующим инкубированием в течение 1 часа при 37^оС как и образцы;

9) через 1 час, добавление 100 мкл реакционного буфера, содержащего 50 мМ Трис/HCl, рН 7,4, 10 мМ -глицерофосфата, 750 мкМ АТР, 5 мМ EDTA, 5 мМ EGTA, 100 мкМ красного Amplex, 8 Ед/мл щелочной фосфатазы, 0,2 Ед/мл холиноксидазы, 2 Ед/мл пероксидазы хрена;

10) инкубирование реакционных смесей в течение 1 часа или более при 37^оС в защищенном от света месте;

11) измерение флуоресценции на флуоресцентном микропланшетном ридере при возбуждении в интервале 530-560 нм и при детекции излучения при 590 нм;

12) для каждого значения, коррекция с учетом фоновой флуоресценции путем вычитания величин, полученных для контроля, не содержащего сфингомиелиназы.

Настоящее изобретение также относится к набору для обнаружения щелочной сфингомиелиназы в кале или в биологических жидкостях пациента в соответствии с вышеописанным способом, где указанный набор содержит тест-пробирки, в которых отдельно содержатся образцы следующих реагентов:

а) сфингомиелина, который должен быть гидролизован щелочной сфингомиелиназой, присутствующей в кале или в биологических жидкостях, с образованием фосфорилхолина;

b) щелочной фосфатазы для катализа гидролиза фосфорилхолина в холин;

с) холиноксидазы для окисления холина в пероксид водорода;

d) пероксидазы хрена для стимуляции реакции пероксида водорода с

е) реагентом “красный Amplex” (10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазином) с образованием флуоресцентного соединения резоруфина, флуоресценция которого является маркером присутствия щелочной СМазы в кале или в биологических жидкостях; и

f) лиофилизованной бактериальной сфингомиелиназы для использования в качестве стандартного концентрата.

Для успешного осуществления аналитического способа настоящего изобретения, помимо вышеуказанных компонентов набора, могут потребоваться нижеследующие дополнительные материалы и оборудование:

сахароза;

хлорид калия (KCl);

одноосновный фосфат калия (КН₂РО₄);

основание Trizma;

EDTA;

хлорид натрия;

таурохолат (ТС);

тауродезоксихолат (TDC);

гликохолат (GC);

гликохенодезоксихолат (GCDC);

-глицерофосфат;

динатриевая АТР-соль;

EGTA;

реагент для анализа на белок ВСА;

бычий сывороточный альбумин;

центрифуга с холодильником;

микропланшетный ридер, который позволяет проводить измерения при 550-562 нм, и

флуориметр для определения интенсивности флуоресценции в микропланшетах.

Для проведения количественной оценки активности СМазы должны быть сделаны нижеследующие измерения.

Построение стандартной кривой

Набор поставляется со стандартным препаратом СМазы, он состоит из бактериального экстракта, содержащего такой тип СМазы, которая действует при рН 9. При этом, должны быть осуществлены следующие операции.

Для построения калибровочной кривой СМазы, стандартный концентрат разводят с получением серийных разведений.

Стандартную СМазу разводят 1 мл аналитического буфера (рН 9,0), в результате чего получают маточный раствор с концентрацией 96 мЕд/мл.

В каждую пробирку пипетируют 0,500 мл аналитического буфера. Маточный раствор используют для получения серийных разведений. Перед последующим переносом, содержимое каждой пробирки тщательно смешивают. Неразведенный стандарт служит в качестве максимального стандарта (96 мЕд/мл), и стандартная кривая будет содержать следующие концентрации (мЕд/мл): 96-48-24-12-6-3. Буфер служит в качестве нулевого стандарта (0 мЕд/мл).

Типичные стандартные кривые

На чертеже представлена стандартная кривая, которая приводится лишь в целях иллюстрации. Стандартная кривая должна быть построена для каждой серии анализируемых проб.

Расчет результатов

Усредняют двойные показания для каждого стандарта и пробы и из них вычитают средние величины флуоресценции для нулевого стандарта.

Для указанных стандартов строят график флуоресценции в зависимости от активности (мЕд/мл) этих стандартов и вычерчивают оптимальную кривую. Для определения активности СМазы в каждой пробе, сначала находят величину флуоресценции на оси y и проводят горизонтальную линию до стандартной кривой. Из точки пересечения опускают вертикальную линию до оси х и считывают соответствующую активность СМазы.

Описанный способ позволяет проводить анализ на активность СМазы in vitro; и этот способ был разработан для обнаружения щелочной СМазы в органическом образце.

Для специфического анализа на щелочную СМазу, в указанном способе используются условия, которые обнаруживают активность кислотной и нейтральной СМазы. Действительно:

– гомогенизирующий буфер имеет нейтральный рН, но он не содержит ингибиторов протеазы и фосфатазы для исключения нейтральной СМазы, так как последняя является чувствительной к активностям протеаз и фосфатаз, а поэтому ингибируется этими ферментами;

– в гомогенизирующем буфере отсутствует MgCl₂, блокирующий активность Mg-зависимой нейтральной СМазы;

– реакционный буфер содержит -глицерофосфат и АТР для подавления, кроме того, активности кислотной СМазы при нейтральном рН, и в этом буфере присутствуют высокие концентрации EDTA и EGTA для ингибирования нейтральной СМазы.

Формула изобретения

1. Способ обнаружения щелочной сфингомиелиназы в пробе, включающий следующие стадии:

1) сбор, сушка и суспендирование образца в гомогенизирующем буфере при нейтральном рН, не содержащем ингибиторов протеазы и фосфатазы;

2) центрифугирование суспендированной пробы с получением супернатанта;

3) отделение супернатанта и помещение его в лунки микропланшета для определения белка;

4) добавление к одной или более лунке, содержащей супернатант аналитического буфера, содержащего EDTA и EGTA в количестве, достаточном для ингибирования нейтральной сфингомиелиназы, сфингомиелина и стандартной концентрации бактериальной сфингомиелиназы при рН 8,9-9,1;

5) через по меньшей мере 1 ч добавление реакционоого буфера, содержащего EDTA и EGTA в количестве, достаточном для ингибирования нейтральной сфингомиелиназы, и -глицерофосфат и ATM для подавления активности кислотной сфингомиелиназы при нейтральном рН;

6) инкубирование реакционной смеси в течение 1 ч или более при 37°С в защищенном от света месте;

7) добавление реагента Amplex Red (10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин) с образованием флуоресцентного соединения резоруфина, флуоресценция которого является маркером присутствия щелочной сфингомиелиназы в пробе и стандартных концентраций сфингомиелиназы с получением значений флуоресценции;

8) коррекция с учетом фоновой флуоресценции путем вычитания значения флуоресценции, полученного из контроля, не содержащего сфингомиелиназы.

2. Способ по п.1, в котором аналитический буфер дополнительно содержит соли желчных кислот.

3. Способ по п.1 или 2, в котором проба содержит биологическую жидкость.

4. Способ по п.3, в котором биологическая жидкость представляет собой желчь.

5. Способ по п.1, в котором проба содержит бактерии, производящие щелочную сфингомиелиназу.

6. Способ по п.1, в котором проба содержит фекалии.

7. Набор для обнаружения щелочной сфингомиелиназы, содержащий следующие реагенты:

a) сфингомиелин;

b) аналитический буфер при рН 8,9-9,1, содержащий EDTA и EGTA в количестве, достаточном для ингибирования нейтральной сфингомиелиназы;

c) -глицерофосфат и АТР;

d) щелочную фосфатазу;

e) холиноксидазу;

f) пероксидазу хрена;

g) реагент Amplex Red (10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазином), образующий флуоресцентное соединение резоруфина, флуоресценция которого является маркером присутствия щелочной сфингомиелиназы.

8. Набор по п.7, дополнительно содержащий соли желчных кислот.

РИСУНКИ