Патент на изобретение №2315998

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЛИЯНИЯ СОЕДИНЕНИЙ НА ПРОЦЕСС СКАЧКА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ И МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ МИТОХОНДРИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для определения соединений, обладающих как цитопротекторным, так и цитостатическим эффектом, что необходимо при поиске лекарственных средств. Способ заключается в том, что измерение этих параметров проводят в одной пробе, путем выделения митохондрий из различных органов, приготовления суспензии митохондрий в буфере, последующего добавления в нее потенциал-зависимого красителя Сафранин А в концентрации 4,5-5,5 мкМ, приготовления плашек с исследуемыми веществами, добавления в них суспензии митохондрий с последующим измерением изменения светопоглощения во времени при длинах волн 554 нм и 524 нм при энергизации митохондрий и после индукции скачка митохондриальной проницаемости, после чего о наличии скачка митохондриальной проницаемости судят по наличию скачкообразного снижения светопоглощения при 554 нм после проведения индукции скачка митохондриальной проницаемости, а о влиянии соединений на мембранный потенциал митохондрий – по изменению величины разности светопоглощений при длинах волн 554 нм и 524 нм потенциал-зависимого красителя сафранина А в суспензии митохондрий под влиянием исследуемых веществ при энергизации митохондрий. Изобретение обеспечивает повышение производительности с одновременным удешевлением способа за счет одновременного определения влияния исследуемого вещества на оба параметра. 2 ил.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для определения соединений, обладающих как цитопротекторным, так и цитостатическим эффектом, что необходимо при поиске лекарственных средств, применяемых, в частности, для лечения нейродегенеративных, кардио- и онкозаболеваний.

В настоящем описании изобретения под термином скачок митохондриальной проницаемости (МРТ – mitochondrial permeability transition) подразумевается такое состояние митохондриальной мембраны, при котором мембрана митохондрий становится проницаемой для веществ с молекулярным весом менее 1500 дальтон и наблюдается изменение формы митохондрий – “набухание” митохондрий.

Мембранный потенциал митохондрий характеризует функциональную активность митохондрий, в основном функционирование их дыхательной цепи, и может определяться различными методами – спектрофотометрическими, флуорометрическими, с помощью электродов.

Под термином “энергизация митохондрий” подразумевается процесс запуска работы дыхательной цепи митохондрий путем добавления субстратов окислительного фосфорилирования, результатом которого является увеличение мембранного потенциала митохондрий.

Под термином ” индукция МРТ” подразумевается процесс запуска скачка митохондриальной проницаемости путем добавления известных (или новых) веществ, которые вызывают появление проницаемости внутренней мембраны митохондрий и ее деполяризацию, что может быть предотвращено предварительным добавлением специфического ингибитора МРТ циклоспорина А. Известен способ определения влияния соединений на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий, который включает получение суспензии митохондрий из различных органов, приготовление плашек с исследуемыми веществами, добавление в них суспензии митохондрий в среде с потенциал-зависимым красителем, в качестве которого используют метиловый эфир тетраметилродамина (ТМРМ). После чего измеряют кинетику изменения флуоресценции и светопоглощения проб, при этом индукцию МРТ проводят последовательным добавлением CaCl₂ и (NH₄)₂HPO₄. Затем строят графики зависимости светопоглощения от времени и зависимости флуоресценции от времени. После чего, по наличию изменения величины (скачкообразного снижения) светопоглощения под влиянием исследуемых веществ судят об изменении формы (“набухании”) митохондрий, в том числе после добавления индукторов это изменение характеризует МРТ, а по изменению флюоресценции, определяемой в той же пробе, судят об изменении мембранного потенциала (Blattner J.R., Lihua He, Lemasters J.J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry, 295, 220-226, 2001).

Однако для осуществления этого способа требуется использование не только дорогого реактива ТМРМ, а также достаточно дорогого и сложного оборудования, в том числе, флюоресцентного плашечного ридера, дающего возможность одновременной регистрации светопоглощения и флуоресценции.

Известен принятый за прототип способ определения влияния соединений на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий, который включает выделение митохондрий из различных органов, приготовление суспенции митохондрий в буфере, в который для энергизации митохондрий дополнительно добавляют субстраты дыхания (5 мМ глутамат натрия +5 мМ малат натрия), приготовление плашек с исследуемыми веществами, добавление в них суспензии митохондрий с последующим измерением кинетики изменения светопоглощения при 535 нм в течение 28 мин во время которого индукцию МРТ проводят добавленим CaCl₂ и (NH₄)₂HPO₄. После чего строят график зависимости светопоглощения суспензии митохондрий с исследуемым веществом при 535 нм от времени и по наличию скачкообразного снижения светопоглощения под влиянием исследуемых веществ судят об изменении формы (“набухании”) митохондрий, т.е. определяют МРТ. Затем в плашки, приготовленные аналогично описанному выше, дополнительно добавляют потенциал-зависимый краситель Сафранин А в концентрации – 15 мкМ и регистрируют начальное значение флуоресценции (потенциал покоя) как в контрольных пробах, так и в присутствии производных исследуемых веществ. Одинаковые значения флуоресценции в контрольных и опытных пробах свидетельствует об отсутствии влияния исследуемых соединений на мембранный потенциал митохондрий. Снижение флуоресценции сафранина А отображает снижение мембранного потенциала в опытных пробах по сравнению с контрольными и свидетельствует о наличии влияния исследуемых соединений на мембранный потенциал митохондрий. Затем добавляют в качестве индукторов МРТ CaCl₂ и (NH₄)₂HPO₄ (как и при измерении “набухания” митохондрий). В конце эксперимента добавляют для контроля полной деполяризации митохондрий (нулевая величина потенциала) известный разобщитель окислительного фосфорилирования – FCCP [carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone] – в концентрации, вызывающей полное изчезновение мембранного потенциала митохондрий. (Waldmeier P.C., Feldtrauer J.J., Ting Qian, Lemasters J.J. Inhibition of the mitochondrial permeability transition by the nonimmunosuppressive Cyclosporin derivative NIM811. Molecular Pharmacology, 62, 22-29, 2002).

Однако этот способ трудоемок и требует значительного времени проведения испытаний.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение производительности с одновременным удешевлением способа определения влияния соединений на процесс МРТ и мембранный потенциал митохондрий, за счет одновременного определения влияния исследуемого вещества на оба этих параметра.

Поставленная задача достигается способом определения влияния соединений на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий, путем выделения митохондрий из различных органов, приготовления суспензии митохондрий в буфере, приготовления плашек с исследуемыми веществами, добавления в них суспензии митохондрий с последующим измерением изменения светопоглощения во времени при энергизации митохондрий и после индукции скачка митохондриальной проницаемости, при этом о наличии скачка митохондриальной проницаемости судят по наличию скачкообразного снижения светопоглощения под влиянием исследуемых веществ после проведения индукции скачка митохондриальной проницаемости, а влияние соединений на мембранный потенциал митохондрий определяют в присутствии потенциал-зависимого красителя Сафранин А при энергизации митохондрий. Новизна предлагаемого способа заключается в том, что измерение скачка митохондриальной проницаемости и мембранного потенциала проводят в одной пробе, при этом Сафранин А добавляют непосредственно при приготовлении суспензии митохондрий, причем концентрация его составляет 4,5-5,5 мкМ, а измерение изменения светопоглощения во времени проводят при длинах волн 554 нм и 524 нм, после чего о наличии скачка митохондриальной проницаемости судят по наличию скачкообразного снижения светопоглощения при 554 нм, а о влиянии соединений на мембранный потенциал митохондрий по изменению величины разности светопоглощений при длинах волн 554 нм и 524 нм потенциал-зависимого красителя сафранина А в суспензии митохондрий под влиянием исследуемых веществ.

Экспериментально было установлено, что концентрациия Сафранина А, равная 4,5-5,5 мкМ, является достаточной для измерений изменений мембранного потенциала, но не влияет на характеристики митохондрий, а величина разности его светопоглощения при длинах волн 554 нм и 524 нм (А554-А524) в суспензии митохондрий характеризует мембранный потенциал митохондрий. Первоначальное увеличение абсолютной величины разницы А554-А524 при энергизации митохондрий после добавления субстратов дыхания отражает появление мембранного потенциала митохондрий, а уменьшение этой разности после добавления исследуемых веществ свидетельствует о влиянии на него этих веществ.

Техническим результатом, который может быть получен при осуществлении изобретения, является возможность одновременно в условиях высокопроизводительного скрининга (в 24-, 48-, 96- и т.д. – ячеечных планшетах) охарактеризовать влияние вещества и на МРТ, и на изменение мембранного потенциала митохондрий.

Возможность осуществления изобретения с реализацией заявляемого назначения и получением технического результата подтверждается, но не исчерпывается следующим примером.

Пример. Скрининг аналогов димебона с целью выяснения вероятности наличия у них влияния на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий.

Митохондрий из печени крыс выделяют стандартным методом дифференциального центрифугирования. Концентрацию белка в полученном препарате митохондрий определяют стандартным биуретовым методом. Препарат митохондрий разводят в среде А (состав: маннитол – 225 мМ, сахароза – 75 мМ, HEPES – 10 мМ, ЭГТА – 20 мкМ) из расчета 0,9 мг белка в 1 мл среды А и непосредственно перед началом измерения в суспензию добавляют сафранин А в конечной концентрации 5 мкМ. Для 24-ячеечного планшета одновременно готовят 4 разведения 2 исследуемых веществ (100 мкМ – 10 мМ) и 10 мкл каждого разведения веществ вносят в опытные ячейки планшета (колонки 2-5 планшета). Ряды А и В одинаковы и содержат вещество 1, ряды С и D одинаковы и содержат вещество 2. В шестую колонку добавляют по 10 мкл максимальной концентрации вещества данного ряда. Затем в каждую ячейку 1-5 колонки планшета вносят по 0,98 мл суспензии митохондрий с сафранином. В ячейки шестого ряда планшета добавлют по 0,98 мл среды А с сафранином, не содержащей митохондрий. После этого планшет помещают в плашечный ридер и записывают светопоглощение при 524 и 554 нм. Через 2,5 мин от начала записи проводят энергизацию митохондрий, добавляя во все пробы по 10 мкл субстратов дыхания (0,5 М раствор глутамата калия и 0,5 М раствор малата калия). Через 5 мин от начала записи проводят индукцию МРТ, добавляя во все пробы планшета по 10 мкл 0,5 М раствора хлористого кальция. Запись светопоглощения продолжают в течение 30 минут. Анализ полученных данных проводят с помощью графика зависимости разности изменения светопоглощения при 524 и 554 нМ от времени. Скачкообразное снижение величины светопоглощения суспензии митохондрий при 554 нм отражает наличие МРТ, т.е. изменение формы митохондрий – “набухание” (см. фиг.1а и 2а).

Уменьшение абсолютного значения величины разности светопоглощения Сафранина А при длинах волн 554 нм и 524 нм (А554-А524) в суспензии митохондрий после добавления субстратов дыхания характеризует увеличение мембранного потенциала митохондрий, а отсутствие различий между контрольными пробами и опытными до добавления индукторов МРТ свидетельствует об отсутствии влияния димебона на мембранный потенциал митохондрий (см. фиг.1б). Большее по сравнению с контролем абсолютное значение величины разности светопоглощения Сафранина А при длинах волн 554 нм и 524 нм (А554-А524) в суспензии митохондрий после добавления субстратов дыхания свидетельствует о влиянии, в данном случае, снижении мембранного потенциала митохондрий аналогом димебона – веществом IP9205 (фиг.2б).

Проведение исследований по способу-прототипу показало наличие тех же характеристик для исследуемых веществ, что и предлагаемый нами способ, в то же время проведения анализа снизилось примерно в 2 раза, кроме того аналогичное число анализов требует вдвое меньшего расхода животных и реактивов.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет оценить действие различных соединений на процесс “набухания” митохондрий, характеризующий связанный с индукцией клеточной гибели процесс МРТ с одновременной оценкой влияния веществ на мембранный потенциал митохондрий. Это дает возможность проводить определение соединений, обладающих как цитопротекторным, так и цитостатическим эффектом, что необходимо при поиске лекарственных средств, применяемых, в частности, для лечения нейродегенеративных, кардио- и онкозаболеваний.

Формула изобретения

Способ определения влияния соединений на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий путем выделения митохондрий из различных органов, приготовления суспензии митохондрий в буфере, приготовления плашек с исследуемыми веществами, добавление в них суспензии митохондрий с последующим измерением изменения светопоглощения во времени при энергизации митохондрий и после индукции скачка митохондриальной проницаемости, при этом о наличии скачка митохондриальной проницаемости судят по наличию скачкообразного снижения светопоглощения под влиянием исследуемых веществ во время проведения индукции скачка митохондриальной проницаемости, а влияние соединений на мембранный потенциал митохондрий определяют в присутствии потенциалзависимого красителя Сафранин А, отличающийся тем, что измерение скачка митохондриальной проницаемости и мембранного потенциала проводят в одной пробе, при этом Сафранин А добавляют непосредственно при приготовлении суспензии митохондрий, причем концентрация его составляет 4,5-5,5 мкМ, а измерение изменения светопоглощения во времени проводят при длинах волн 554 нм и 524 нм, после чего о наличии скачка митохондриальной проницаемости судят по наличию скачкообразного снижения светопоглощения при 554 нм, а о влиянии соединений на мембранный потенциал митохондрий по изменению величины разности светопоглощений при длинах волн 554 нм и 524 нм потенциалзависимого красителя сафранина А в суспензии митохондрий под влиянием исследуемых веществ.

РИСУНКИ