Патент на изобретение №2315315

(54) СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиопедиатрии. Для ранней диагностики туберкулезной инфекции у детей определяют уровень пролиферации лимфоцитов в микрокультурах цельной крови по реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с аллергеном туберкулином (ППД-Л) в 6 разведениях. Оценивают индекс стимуляции специфического клеточного ответа по определению индекса стимуляции. При показателях индекса стимуляции менее 3,2 диагностируют отсутствие инфицирования микобактериями туберкулеза. При индексе стимуляции более 3,2 диагностируют инфицирование микобактериями туберкулеза, а при показателе более 12,1 – активный туберкулезный процесс. Использование способа позволяет повысить качество и точность ранней диагностики туберкулезной инфекции у детей. 1 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”07.04.1992. ЛЕБЕДЕВ К.А. и др. Иммунограмма в клинической практике. – М.: Наука, 1990, с.71-72. CHANDRASEKHAR S et al. Association of increased mycobacterium growth inhibitory factor with antituberculous immunity. Eur Respir J., 1991, 4(7), p.783-788, PMID: 1954999, реф., [он-лайн], [найдено 20.10.2006], найдено из базы данных PubMed.

Изобретение относится к медицине, преимущественно к фтизиопедиатрии, может быть использовано для диагностики первичного инфицирования, скрытой активности туберкулеза у детей и оценки эффективности специфической терапии.

Известен иммунологический метод определения противотуберкулезных антител – иммуноферментный анализ (ИФА). В диагностике туберкулеза серологические методы, в том числе ИФА, не оправдали всех возлагавшихся надежд, поскольку не удалось обнаружить специфичных антигенов M.tuberculosis, на которые у большинства больных вырабатываются соответствующие антитела. Существующие иммуноферментные тест-системы обладают специфичностью на уровне 90-94% (6-10% ложноположительных результатов у здоровых лиц или больных нетуберкулезными заболеваниями), тогда как чувствительность (число положительных результатов у больных активным туберкулезом) составляет в среднем около 70%. Поэтому говорить о самостоятельном значении данного метода для дифференциальной диагностики туберкулеза органов дыхания пока не представляется возможным (Диагностика и химиотерапия туберкулеза органов дыхания. Пособие для врачей. – М.: Медицина и жизнь, 2003. – 48 с.), так же как и для дифференциальной диагностики инфицирования микобактериями туберкулеза и парааллергии, чувствительность ИФА у инфицированных составляет 23,2% (Некрасов С.В. Диагностическая и прогностическая значимость определения противотуберкулезных антител при инфицировании и заболевании туберкулезом легких у детей и взрослых: Автореф. дис….канд. мед. наук. – М., 1999. – 23 с.).

Известна реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с туберкулином (ППД-Л) для оценки состояния специфического клеточного иммунитета, используемая в клинике (особенно в комплексе с рядом других иммунологических тестов) для дифференциальной диагностики туберкулеза, оценки активности его течения и выявления минимальной активности туберкулезных поражений. Механизм этой реакции состоит в трансформации лимфоцитов в бластные клетки под действием специфического митогена – туберкулина. Реакция состоит из 3-х этапов (Абрамова З.П., Дубровская Н.А., Еремеев В.В., Авербах М.М. Сравнительное определение пролиферативной активности лимфоцитов в макро- и микроварианте реакции бласттрансформации у больных туберкулезом. Актуальные вопросы лабораторной диагностики туберкулеза в эксперименте и клинике. – М., 1989. – С.114-116):

1. выделение лимфоцитов (или лейкоцитарной массы);

2. культивирование лимфоцитов (лейкоцитов) с ППД-Л;

3. оценка результатов.

Недостатки методики: невысокий процент выявления повышенного уровня бластообразования (положительных результатов) можно объяснить потерей лимфоцитов на этапе их выделения (на фекол-верографине). Для оптимального протекания РБТЛ необходимо присутствие макрофагов, поэтому использовать высокоочищенные лимфоциты не рекомендуется (Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике. – М.: Наука, 1990. – 224 с.).

Задачей изобретения является повышение качества и сокращение времени ранней диагностики туберкулезной инфекции у детей.

Поставленная задача решается тем, что в способе ранней диагностики туберкулезной инфекции у детей, включающем оценку состояния специфического клеточного иммунитета с помощью реакции бластной трансформации лимфоцитов с туберкулином, отличающемся тем, что РБТЛ проводят с использованием микрокультур цельной крови с аллергеном туберкулезным (ППД-Л), используют 6 разведений и параллельно с фитогемагглютинином (ФГА), оценивают уровень специфического клеточного ответа по определению индекса стимуляции и при показателях индекса стимуляции менее 3,2 диагностируют отсутствие инфицирования микобактериями туберкулеза, при индексе стимуляции более 3,2 диагностируют инфицирование микобактериями туберкулеза, а при показателе более 12,1 – активный туберкулезный процесс.

Разработанная реакция на основании РБТЛ (модифицированная РБТЛ с ППД-Л) позволила повысить информативность данного иммунологического теста. При выполнении теста исключены потери Т-лимфоцитов и других клеток крови, принимающих участие в реакции (макрофаги), использовано несколько доз антигена (6 разведений), параллельно с туберкулином реакцию осуществляют с неспецифическим митогеном – фитогемагглютинином (как показатель вторичного иммунодефицита). Возможность использования малого объема крови (200 мкл). Оценку метода проводят по степени активности включения ³H-тимидина (используя для этого автоматический сцинтилляционный счетчик).

Постановку РБТЛ проводят с использованием микрокультур цельной крови с ФГА и параллельно с ППД-Л без выделения лимфоцитов. Гепаринизированную кровь (25 ЕД гепарина на 1 мл крови) культивируют в круглодонных иммунологических планшетах, в полной ростовой среде (ПРС) (среда 199, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамин (2 мМ), HEPES (10 мМ), гентамицина сульфат 50 мкг/мл) – контрольные образцы крови. Опытные образцы крови культивируют в ПРС, содержащей ФГА (0,06 мл), в течение 120 часов и в ПРС, содержащей ППД-туберкулин (0,06 мл) в 6 разведениях (50; 25; 12,5; 6,25; 3,1; 1,55 мкг/мл), также в течение 120 часов. За 18 часов до окончания культивирования в культуры клеток (контрольную и опытную) вносят по 1 мкCi ³H-тимидина. По окончании культивирования клетки крови собирают полуавтоматическим сборщиком клеток на стекловолоконные фильтры и высушивают. Подсчет радиоактивности в имп./мин проводят в сцинтилляционной жидкости с помощью «Betta-2» камеры. Оценку уровня специфического клеточного ответа проводят по определению индекса стимуляции (и.с.) по формуле:

Установлено, что результат индекса стимуляции лимфоцитов до 3,2 – отрицательный, более 3,2 – положительный.

В исследованиях была определена специфичность и чувствительность мРБТЛ с ППД-Л. Установлена высокая специфичность – 97,9% и чувствительность метода – 97,8%. Доля истинных результатов мРБТЛ с ППД-Л составила 97,8±1,1%.

Нами была исследована информативность показателя пролиферации лимфоцитов при стимуляции туберкулином (мРБТЛ с ППД-Л) у 279 детей. Среди них у 117 (41,9%) детей 2-17 лет рентгенологически был подтвержден туберкулез органов дыхания, в том числе в фазе инфильтрации у 72 (61,5%), в фазе распада у 6 (5,1%), в фазе рассасывания и уплотнения у 11 (9,4%), кальцинации у 16 (13,7%) и внелегочных локализаций. Инфицирование диагностировано у 107 (38,4%) детей дошкольного и младшего школьного возраста, с неуточненным инфицированном 24 (8,6%). Здоровых, не реагирующих на туберкулин или с сомнительными результатами пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л – 31 (11,1%) ребенок дошкольного возраста, из них 9 детей были обследованы в динамике через 6-12 месяцев. Всего в рамках исследования было выполнено 293 анализа.

Полученные результаты отражены в таблице 1, как видно из таблицы, уровень пролиферативного ответа лимфоцитов на туберкулин у детей неинфицированных, инфицированных (в том числе и в период «виража») и больных туберкулезом достоверно (р=0,000) различался.

При обследовании детей, больных туберкулезом в фазе инфильтрации, до лечения пролиферация лимфоцитов на туберкулин у всех (100%) была выражена, при этом результаты по фазам туберкулезного процесса до лечения достоверно не различались (р=0,302).

Анализируя динамику пролиферации лимфоцитов на туберкулин во время лечения, установили, что в течение первых 2 месяцев достоверного снижения средних величин не выявлялось (р>0,05), в течение третьего месяца лечения отметили снижение на 43% от исходного, но достоверно не значимо (р>0,05). Статистически достоверное различие (р=0,005) с исходным уровнем наблюдали лишь у больных, получивших противотуберкулезную терапию (2-3 препарата) в течение 6 и более месяцев.

При обследовании 24 детей из диагностической «0» группы у 14 детей был установлен индекс стимуляции ниже 3,1, что соответствовало уровню неинфицированных. Для 6 детей были проведены повторные исследования (контроль через год), при этом у всех обследованных сохранялась слабо выраженная пролиферация на туберкулин. У 11 детей с низким уровнем индекса стимуляции также отметили и снижение чувствительности к туберкулину (сомнительные результаты пробы) в реакции Манту с 2 ТЕ ППД-Л после подготовки к пробе, у 3 детей сохранился положительный результат.

Таким образом, положительные результаты пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л при слабо выраженной пролиферации на туберкулин нами были расценены как проявление парааллергии и на их долю пришлось 12±2,7%.

Нами был установлен высокий уровень корреляционной зависимости между пробой Манту с 2 ТЕ ППД-Л и мРБТЛ с ППД-Л (r=0,71 по Спирмену и r=0,91 – коэффициент знаковой корреляции).

Полученные результаты проведенных исследований мРБТЛ с ППД-Л позволяют утверждать, что детей с положительной туберкулиновой пробой, у которых индекс стимуляции не более 3,1, следует относить к группе неинфицированных, а положительную реакцию Манту с 2 ТЕ ППД-Л расценивать как парааллергию (с 3-х лет). Детей с положительной реакцией Манту с 2 ТЕ ППД-Л и с индексом стимуляции более 3,2 считать инфицированными микобактериями туберкулеза. У детей с положительной реакцией Манту с 2 ТЕ ППД-Л и с индексом стимуляции более 12,1 результаты оценивать как активный туберкулезный процесс несмотря на отсутствие рентгенологических данных.

Примерами информативности определения уровня специфического клеточного ответа при первичной туберкулезной инфекции у детей могут служить следующие выписки из историй болезни.

Пример 1. Дмитрий К., 2 г. 5 мес, карта стационарного больного №17/03, поступил в стационар 28.01.03 г. на лечение. Клинический диагноз: Туберкулез внутригрудных лимфатических узлов бронхопульмональной группы в фазе инфильтрации, МБТ – (эпид. №18604).

С декабря 2002 года установлен контакт с матерью. При обследовании в январе 2003 года выявили гиперергическую реакцию на туберкулин (проба Манту с 2 ТЕ ППД-Л) – инфильтрат 15 мм с некрозом, что совпало с впервые положительным результатом. При поступлении жалоб не было, но наблюдали проявление интоксикации в виде бледных кожных покровов, дефицита массы тела, при пальпации определялись увеличенные до второго размера периферические лимфатические узлы в 5 группах. По другим органам и системам без особенностей. При поступлении был определен уровень специфического клеточного ответа в мРБТЛ с ППД-Л, индекс стимуляции составил 17,4.

При рентгенологическом обследовании патологические изменения, характерные для туберкулеза, были выявлены только через 10 месяцев от начала лечения.

Лечение проводилось фтивазидом и пиразинамидом. Контроль результатов пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л провели через 5 месяцев – папула 12 мм. В динамике, через 6 месяцев лечения индекс стимуляции составил 5,5.

Таким образом, с помощью мРБТЛ с ППД-Л была подтверждена активность первичной туберкулезной инфекции и эффективность проводимой химиотерапии.

Пример 2. Адена С., 10 л. 11 мес, карта стационарного больного №141/03, поступила в стационар 10.11.2003 г. с целью исключения туберкулеза мочевой системы.

С рождения наблюдалась у нефролога по поводу врожденной аномалии МВС. С 6 лет наблюдалась у фтизиатра по поводу «виража» туберкулиновых проб, предупредительная химиотерапия не проводилась. Контакт не был установлен. Вакцинирована БЦЖ при рождении, рубец 5 мм. Проба Манту с 2 ТЕ ППД-Л в сентябре 2003 г – инфильтрат 11 мм.

При поступлении в стационар проявлений туберкулезной интоксикации не наблюдалось. При осмотре по органам и системам патологических изменений выявлено не было. Была проведена проба Коха с 50 ТЕ ППД-Л, результат отрицательный.

Был определен уровень специфического клеточного ответа в мРБТЛ с ППД-Л, индекс стимуляции составил 4,8, что соответствует уровню инфицирования микобактериями туберкулеза.

Таким образом, на основании полученных данных туберкулез был исключен. Ребенок был выписан из стационара 05.12.2003 г. с клиническим диагнозом: Врожденная аномалия развития МВС. Хронический пиелонефрит, рецидивирующее течение. Нейрогенная дисфункция мочевого пузыря.

Пример 3. Ольга Г., 14 лет, карта стационарного больного №77/03, поступила в стационар 18.06.2003 г. для уточнения диагноза и лечения. Клинический диагноз: Туберкулез мочевой системы: паренхиматозный туберкулез почек, двусторонний, МБТ±?

С 2001 г. наблюдается у фтизиатра в связи с нарастанием туберкулиновых проб, однократно при посеве мочи обнаружены микобактерии туберкулеза, установлен семейный контакт. Вакцинация БЦЖ при рождении и ревакцинация в 7 лет, один рубец 3 мм. Проба Манту с 2 ТЕ ППД-Л в мае 2003 г. – инфильтрат 15 мм.

При поступлении в стационар проявлений туберкулезной интоксикации не наблюдалось. При осмотре по органам и системам патологических изменений выявлено не было. Была проведена проба Коха с 50 ТЕ ППД-Л, результат сомнительный. При рентгенологическом обследовании органов грудной клетки патологии не выявили. На экскреторных урограммах патологических изменений со стороны почек и мочевых путей не было выявлено.

Был определен уровень специфического клеточного ответа в мРБТЛ с ППД-Л, индекс стимуляции составил 22,9, что подтвердило специфичность инфекции и ее активность.

Лечение проводилось изониазидом, рифампицином, стрептомицином. Отметили положительную клиническую динамику.

Пример 4. Вера М., 6 л. 8 мес, индивидуальная карта ребенка ф. №026/у, поступила в санаторный сад 03.10.2002 г. на санаторное лечение. Клинический диагноз: Тубинфицирование? Лимфаденопатия внутригрудных лимфатических узлов неясной этиологии. Дисметаболическая нефропатия.

С 2001 г. имела непостоянный контакт с дядей, больным туберкулезом легких. Вакцинация при рождении, рубец 6 мм. В течение 3-х лет туберкулинодиагностика не проводилась. Проба Манту с 2 ТЕ ППД-Л в августе 2001 г. – инфильтрат 8 мм. На учете у фтизиатра с июля 2002 г. по «0» группе.

При поступлении в санаторный сад жалобы на частые простудные заболевания, нарушение стула (склонность к поносам). При осмотре кожные покровы чистые, обычной окраски, язык был обложен беловатым налетом, имелись кариозные зубы, гипертрофия небных миндалин до II размера. При пальпации определялись множественные, увеличенные до II-III размера периферические лимфатические узлы в 3 группах (передне-шейные, задне-шейные, аксилярные). Лимфатические узлы были плотно-эластичной консистенции, не спаянные с окружающей тканью, безболезненные. При аускультации выслушивали систолический шум в точке Боткина. По другим органам и системам без особенностей. Проба Манту с 2 ТЕ ППД-Л – инфильтрат 9 мм. Был определен уровень специфического клеточного ответа в мРБТЛ с ППД-Л, индекс стимуляции составил 2,6, что свидетельствовало об отсутствии туберкулезной инфекции. При рентгенологическом обследовании органов грудной клетки в прямой проекции корни обогащены, структура правого корня была нечеткая, в боковой проекции патологических изменений не выявили.

В течение 3 месяцев была проведена подготовка к пробе Манту, контроль в ноябре 2002 г. – инфильтрат 3 мм (результат при повторном обследовании в апреле 2003 г. тот же). При рентгенологическом контроле в ноябре 2002 г. патологии не выявили. При контрольном иммунологическом исследовании через четыре месяца сохранялась невыраженная пролиферация на туберкулин (индексе стимуляции 2,0).

Таким образом, было подтверждено отсутствие инфицирования, а имевшие место изменения были расценены как проявление неспецифической инфекции.

По нашему мнению, учитывая высокую специфичность и чувствительность метода, использование мРБТЛ с ППД-Л в клинической практике в сочетании с другими методами позволит повысить качество диагностики специфического воспаления, оценить эффективность специфического лечения, сократить сроки диагностики инфекционной аллергии, следовательно, провести своевременную профилактику развития локальных форм туберкулеза у детей.

Формула изобретения

Способ ранней диагностики туберкулезной инфекции у детей, включающий оценку состояния специфического клеточного иммунитета с помощью реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с туберкулином (ППД-Л), отличающийся тем, что РБТЛ проводят с использованием микрокультур цельной крови с аллергеном туберкулезным (ППД-Л) в 6 разведениях, оценивают уровень специфического клеточного ответа по определению индекса стимуляции и при показателях индекса стимуляции менее 3,2 диагностируют отсутствие инфицирования микобактериями туберкулеза, при индексе стимуляции более 3,2 диагностируют инфицирование микобактериями туберкулеза, а при показателе более 12,1 – активный туберкулезный процесс.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Извещение опубликовано: 27.04.2009 БИ: 12/2009