Патент на изобретение №2315112
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОТБОРА МИКРООРГАНИЗМОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К КАТИОННЫМ АНТИМИКРОБНЫМ ПЕПТИДАМ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ
(57) Реферат:
Изобретение относится к промышленной микробиологии и биотехнологии может быть использовано для отбора референс-культур микроорганизмов с целью тестирования антимикробной активности катионных антимикробных пептидов, выделенных из различных источников или синтезированных de novo, а также антимикробной активности сыворотки крови различного происхождения. Взвесь микроорганизмов вносят в двухфазную систему “жидкость-жидкость” с несмешивающимися водными фазами, обогащенными полиэтиленгликолем и декстраном, и инкубируют. Отбирают декстрансодержащую и полиэтиленгликольсодержащую фазы и определяют индекс резистентности микроорганизмов к катионным антимикробным пептидам и сыворотке крови. Отбирают микроорганизмы из декстрансодержащей фазы с индексом резистентности 0,58-1,06. Изобретение позволяет эффективно и быстро отобрать микроорганизмы, обладающие повышенной устойчивостью к катионным антимикробным пептидам и сыворотке крови. 3 табл.
(56) (продолжение): CLASS=”b560m”Staphylococcus aureus adherence to platelets in vitro. Infect. Immun., 1994, v. 62, no 8, p. 3416-3423. DHAWAN V.K., YEAMAN M.R., CHEUNG A.L. et al. Phenotypic resistance to thrombin-induced platelet microbicidal protein in vitro is correlated with enhanced virulence in experimental endocarditis due to Staphylococcus aureus. Infect. Immun., 1997, v. 65, no 8, p. 3293-3299. КЕРАШЕВА С.И., ОСТРОВСКИЙ А.Д., ИЛИНСКАЯ В.В. Микробиологические методы идентификации вирулентного протея. Вопросы физиологии, метаболизма и идентификации микроорганизмов. Сборник научных трудов. – М., 1987, с.113-115.
Изобретение относится к промышленной микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для отбора референс-культур микроорганизмов с целью тестирования антимикробной активности катионных антимикробных пептидов, выделенных из различных источников или синтезированных de novo. Рост инфекций, вызванных микроорганизмами, проявляющими устойчивость ко многим антимикробным препаратам [1, 2], диктует необходимость расширения арсенала лекарственных средств, обладающих микробицидным действием [3]. Известно, что выраженным антимикробным действием обладают катионные пептиды, выделенные из тканей животных и человека [4]. Известно использование антимикробных пептидов, выделенных из тканей человека [5], крупного рогатого скота [6], мыши [7], а также синтетических и рекомбинантных пептидов [8] для лечения и профилактики инфекционных заболеваний. Однако в настоящее время к антимикробным пептидам растет уровень устойчивости среди различных микроорганизмов [9], что диктует необходимость скрининг-отбора штаммов, обладающих повышенной устойчивостью к бактерицидному действию антимикробных пептидов и сыворотки крови (как одного из источников получения антимикробных пептидов [10]), с целью создания оптимальных методик преодоления данной резистентности. Известен способ отбора микроорганизмов, обладающих повышенной устойчивостью к катионным антимикробным пептидам, путем серийных пассажей штаммов микроорганизмов в среде, содержащей антимикробные пептиды [11]. Однако указанный способ является длительным по времени и сохраняет стабильность устойчивости микроорганизмов к катионным антимикробным пептидам только в течение нескольких пересевов [12]. Известно получение микроорганизмов, устойчивых к катионным антимикробным пептидам, основанное на конструировании штаммов методом транспозонного мутагенеза [13, 14] или создании плазмид, несущих детерминанты устойчивости, с последующей гомологичной рекомбинацией [14, 15]. Однако указанные способы являются трудоемкими, требуют наличия специальной аппаратуры и генетического банка бактериальных плазмид и плазмидных векторов. Заявляемый способ решает задачу упрощения методов отбора микроорганизмов, обладающих повышенной устойчивостью к катионным антимикробным пептидам и сыворотке крови, и сокращения времени отбора данных микроорганизмов. Для решения указанной задачи в заявляемом способе отбора микроорганизмов, обладающих повышенной устойчивостью к катионным антимикробным пептидам и сыворотке крови, из чистых культур микроорганизмов готовят взвеси, добавляют взвесь микроорганизмов в двухфазную систему «жидкость-жидкость» с несмешивающимися водными фазами, обогащенными полиэтиленгликолем и декстраном, встряхивают, инкубируют, отбирают фазу, содержащую декстран, и лиофилизируют. Новым в заявляемом способе является то, что из чистых культур микроорганизмов готовят взвеси, добавляют взвесь микроорганизмов в двухфазную систему «жидкость-жидкость» с несмешивающимися водными фазами, обогащенными полиэтиленгликолем и декстраном, встряхивают, инкубируют, отбирают фазу, содержащую декстран, и лиофилизируют. Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что заявляемый способ путем разделения микроорганизмов в двухфазной системе «жидкость-жидкость» с несмешивающимися водными фазами, обогащенными полиэтиленгликолем и декстраном, позволяет сократить сроки получения микроорганизмов, обладающих повышенной устойчивостью к катионным антимикробным пептидам и сыворотке крови. Авторами экспериментально установлено, что при разделении микроорганизмов в двухфазной системе «жидкость-жидкость» с несмешивающимися водными фазами, обогащенными полиэтиленгликолем и декстраном, в фазе, содержащей декстран, находятся микроорганизмы, обладающие повышенной устойчивостью к сыворотке крови. Проводился следующий эксперимент. Из суточных агаровых культур Esherichia coli (n=19) в физиологическом растворе готовили микробные взвеси, содержащие 109 КОЕ/мл. Двухфазную систему «жидкость-жидкость» с несмешивающимися водными фазами, обогащенными полиэтиленгликолем и декстраном, готовили известным способом [16]. В 2 мл двухфазной системы вносили 0,5 мл микробной взвеси, шуттелировали в течение 2 минут, инкубировали в течение 10 минут при 37°С. Отбирали по 0,6 мл фракций, содержащих полиэтиленгликоль и декстран, добавляли к каждой фракции по 1,2 мл физиологического раствора. К каждой фракции добавляли 0,2 мл сыворотки крови в разведении 1:1, инкубировали при 37°С, добавляли 2 мл мясопептонного бульона, инкубировали при 37°С в течение 3 часов и замеряли оптические плотности выросших культур на спектрофотометре СФ-46 (
Способ осуществляется следующим образом. Из чистых агаровых или бульонных культур микроорганизмов готовят микробные взвеси. В двухфазную систему «жидкость-жидкость» с несмешивающимися водными фазами, обогащенными полиэтиленгликолем и декстраном, вносят микробную взвесь, встряхивают на вортексе, инкубируют при 37°С в течение 10-15 минут. Отбирают фазу, содержащую декстран, и лиофилизируют. Примеры конкретного выполнения способа. Пример 1. Из коллекции Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН были взяты 10 штаммов Staphylococcus epidermidis. Из суточных агаровых культур бактерий приготовили микробные взвеси. Внесли по 0,5 мл микробной взвеси в 2 мл двухфазной системы «жидкость-жидкость» с несмешивающимися водными фазами, обогащенными полиэтиленгликолем и декстраном. Встряхнули в течение 2 минут на вортексе, проинкубировали при 37°С в течение 15 минут, отобрали фазу, содержащую декстран, и лиофилизировали. Параллельно определили индекс резистентности стафилококков из полиэтиленгликоль- и декстрансодержащих фракций к антимикробному белку тромбоцитов (АБТ) и лейкоцитарным катионным белкам (ЛКБ). Антимикробный белок тромбоцитов и лейкоцитарные катионные белки получили известными способами [18, 19]. Для определения индекса резистентности отобрали по 0,6 мл фракций, содержащих полиэтиленгликоль и декстран, добавили к каждой фракции по 1,2 мл физиологического раствора. К каждой фракции добавляли 0,2 мл разведения антимикробных пептидов в концентрации 5 мг/мл для ЛКБ и 140 мкг/мл для АБТ, инкубировали при 37°С, добавляли 2 мл мясопептонного бульона, инкубировали при 37°С в течение 3 часов и замеряли оптические плотности выросших культур на спектрофотометре СФ-46 ( Результаты представлены в таблице 2.
Пример 2. Из коллекции Института клеточного и внутриклеточного симбиоза были взяты 14 штаммов E.coli. Отбор микроорганизмов, обладающих повышенной устойчивостью к катионным антимикробным пептидам и сыворотке крови, осуществили согласно примеру 1. Параллельно определили индекс резистентности бактерий из полиэтиленгликоль- и декстрансодержащих фракций к сыворотке крови (разведение 1:1), АБТ (в концентрации 280мкг/мл) и ЛКБ (в концентрации 10 мг/мл) согласно примеру 1. Результаты представлены в таблице 3.
Таким образом, использование заявляемого способа позволяет эффективно и быстро отобрать микроорганизмы, обладающие повышенной устойчивостью к катионным антимикробным пептидам и сыворотке крови. Источники информации 2. Дерябин Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность. – Екатеринбург: УрО РАН, 2000. – С.174-186. 5. US Patent 5338724, A 61 K 037/02, 16.08.1994. 6. US Patent 6211148, А 61 К 038/16, 03.04.2001. 7. US Patent 6008195, С 07 К 007/08, 28.12.1999. 8. US Patent 6838435, А 61 К 38/00, 04.01.2005. 17. Гриценко В.А., Гриценко Я.В. Чувствительность и адаптация стафилококков к бактерицидному действию катионного белка лейкоцитов 18. Бухарин О.В., Черешнев В.А., Сулейманов К.Г. Антимикробный белок тромбоцитов. – Екатеринбург: УрО РАН, 2000. – С.35-99. Формула изобретения
Способ отбора микроорганизмов, обладающих повышенной устойчивостью к катионным антимикробным пептидам и сыворотке крови, характеризующийся тем, что из чистой культуры микроорганизма готовят взвесь, добавляют ее в двухфазную систему “жидкость-жидкость” с несмешивающимися водными фазами, обогащенными полиэтиленгликолем и декстраном, встряхивают, инкубируют, отбирают декстрансодержащую и полиэтиленгликольсодержащую фазы и определяют индекс резистентности исследуемых микроорганизмов к катионным антимикробным пептидам и сыворотке крови, при этом отбирают микроорганизмы из декстрансодержащей фазы с индексом резистентности 0,58-1,06.
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 07.03.2008
Извещение опубликовано: 10.02.2010 БИ: 04/2010
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
=540 нм). В контрольные пробы вместо сыворотки крови добавляли равный объем физиологического раствора. Устойчивость бактерий к сыворотке крови рассчитывали по индексу резистентности (ИндР, %) известным способом [17]. Результаты эксперимента представлены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, клетки бактерий E.coli, полученные из декстрансодержащей фракции, являются достоверно более устойчивыми к бактерицидному действию сыворотки крови, чем клетки, полученные из полиэтиленгликольсодержащей фракции.
интерцида