Патент на изобретение №2315105

(54) ШТАММ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS PS107(pPIC9HAbIL-2), ЯВЛЯЮЩИЙСЯ ПРОДУЦЕНТОМ ГИБРИДНОГО БЕЛКА, СОСТОЯЩЕГО ИЗ АЛЬБУМИНА ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pPIC9HAbIL-2 И СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения препаратов гибридных белков. Штамм дрожжей Pichia pastoris PS99 (his4 pep4::PHO85) трансформируют сконструированной плазмидой pPIC9HAbIL-2 и получают штамм Pichia pastoris PS107 (pPIC9HAbIL-2) – продуцент гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека. Изобретение обеспечивает получение высокостабильного гибридного белка альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека по упрощенной технологии. 3 н.п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, к генной инженерии, микробиологической и медицинской промышленности и представляет собой дрожжевой штамм – продуцент гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и интерлейкина-2 (ИЛ-2) человека, содержащий сконструированную in vitro плазмиду, которая обеспечивает синтез и секрецию данного гибридного белка. Настоящее изобретение частично основано на обнаружении того факта, что гибридные белки, содержащие альбумин плазмы крови человека, присоединенный к целевому белку, обладают улучшенными фармакокинетическими свойствами, такими как более продолжительное время полужизни (Yeh P. et al. – Proc. Natl. Acad. Sci. – 1992. – V.89. – P.1904-1908; Smith В. et al. – Bioconjugate Chem. – 2001. – V.12. – P.750-756; Halpern W. et al. – Pharm. Res. – 2002. – V.19. – P.1720-1729).

ИЛ-2 продуцируется Т-лимфоцитами в ответ на антигенную и митогенную стимуляцию или под влиянием ИЛ-1 (Gillis S. et al.- J. Immunol. – 1978. – V.120. – Р.2027-2032).

Основная функция ИЛ-2 состоит в обеспечении клеточной составляющей адаптивного иммунитета. ИЛ-2 является фактором роста и дифференцировки Т-лимфоцитов, NK-клеток, обеспечивает дифференцировку Т-киллеров и способствует проявлению функциональной активности Т-хелперов. Он также воздействует на моноциты, экспрессирующие рецептор ИЛ-2, и усиливает синтез иммуноглобулинов предварительно активированными В-лимфоцитами (Smith К. – Science. – 1988. – V.240. – P.1169-1176).

Широкий спектр биологических активностей ИЛ-2 явился мощным стимулом для использования его в качестве лекарственного препарата и для создания рекомбинантных штаммов микроорганизмов – продуцентов этого цитокина.

В настоящее время в России зарегистрированы и применяются два рекомбинантных ИЛ-2 человека: «Пролейкин» (Chiron Corp., США) и «Ронколейкин» (Биотех, Россия). Действующим началом «Пролейкина» является ИЛ-2 человека, синтезированный в клетках Е.coli. Рекомбинантный белок не гликозилирован и является мутеином, у него отсутствует N-концевой аланин и цистеин в 125 положении замещен серином. Значительные побочные эффекты, сопровождающие клиническое применение «Пролейкина», а также высокая стоимость препарата ограничивают его широкое использование.

«Ронколейкин» представляет собой ИЛ-2 человека, синтезированный в клетках дрожжей S.cerevisiae. Известными применяемыми штаммами являются ВКПМ Y-791 (Мясников А.Н. и др., SU 17703359) и ВКПМ Y-3079 (Смирнов М.Н. и др., SU 2230781). Рекомбинантный белок, как и в случае «Пролейкина», накапливается внутри клеток в восстановленном состоянии в виде «телец включения» и не содержит углеводного компонента. Но в отличие от «Пролейкина» в молекуле «Ронколейкина» отсутствуют аминокислотные замены, и он не является мутеином.

Существенным недостатком ИЛ-2 является короткий период полужизни, поэтому в процессе лечения необходимы частые инъекции препарата. Это удорожает лечение, может сопровождаться побочными эффектами и отрицательно сказываться на качестве жизни пациентов (Winkelhake J., Gauny S. – Pharmacol. Rev. – 1990. – V.42. – P.1-28; Nadeau R. et al., Drug Metabol. Dispos. – 1995. – V.23. – P.904-909).

Для увеличения периода полужизни рекомбинантных белков используют модификацию молекулы белка, которая заключается в ковалентном связывании активного белка с полиэтиленгликолем (ПЭГ) или альбумином.

Пегилирование ИЛ-2 сопровождается увеличением периода полужизни препарата, замедлением выведения, понижением токсичности и иммуногенности (Katre N. et al. – Proc. Natl. Acad. Sci. – 1987. – V.84. – P.1487-1491; Knauf M. et al. – J. Biol. Chem. – 1988. – V.263. – P.15064-15070; Chapes S. et al. – J. Appl. Physiol. – 1999. – V.86. – P.:2065-2076). Однако ПЭГ-конъюгаты не лишены недостатков, среди которых следует отметить зависимость активности белка от структуры ПЭГ (Veronese F. – Biomaterials. – 2001. – V.22. – Р.405-417).

Особый интерес представляет модификация рекомбинантных белков за счет их слияния с молекулой альбумина человека. Альбумин является основным белком плазмы крови человека. Период полужизни альбумина около 19 дней. Он обладает рядом ценных свойств, главным из которых является его способность связывать и транспортировать эндо- и экзогенные лиганды (в том числе и белки). Альбумин играет роль естественного стабилизатора и переносчика белков плазмы крови. Он широко используется в качестве стабилизирующего агента при формулировании лекарственных препаратов, созданных на основе белков (Peters Т. – All about albumin. – 1996. – Academic Press).

Все вышеизложенное свидетельствует о потребности в создании штаммов микроорганизмов – продуцентов гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека.

Использование для гетерологичной экспрессии метилотрофных дрожжей Pichia pastoris представляет особый интерес. Гликопротеины, секретируемые дрожжами Pichia pastoris, не содержат маннозных остатков, связанных 1,3-связями и являющихся сильными антигенными детерминантами, что позволяет получать наряду с внутриклеточными аутентичные секреторные формы рекомбинантных белков (Montesino R. et al. – Protein Expr. Purif. – 1998. – V.14. – P.197-207). Получение секреторного продуцента гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, было бы особенно актуально. Природный ИЛ-2 является секреторным белком и только в процессе секреции происходит правильное замыкание внутримолекулярной дисульфидной связи и гликозилирование белка. От корректного замыкания дисульфидной связи зависит биологическая активность ИЛ-2, а присоединение углеводных остатков повышает стабильность молекулы и увеличивает время ее циркуляции в кровотоке (Robb R. et al.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1984. – V.81 – P.6486-6490). Накопление рекомбинантного белка в культуральной жидкости значительно упрощает процедуру его очистки.

Таким образом, в задачу настоящего изобретения входило создание штамма, желательно дрожжей Pichia pastoris, синтезирующего гибридный белок, состоящий из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, и секретирующего данный гибридный белок в культуральную жидкость, создание плазмиды, которая позволила бы синтезировать упомянутый гибридный белок в дрожжах Pichia pastoris, а также предложение способа конструирования такой плазмиды.

Указанная задача решена предложением плазмиды pPIC9HAbIL-2, которая обеспечивает синтез и секрецию гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, трансформированными ею клетками дрожжей, состоящей из следующих элементов:

– EcoRI-XhoI – фрагмента плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектора рРIС9 размером 8,00 т.п.о., включающего бактериальный ген устойчивости к ампициллину, бактериальную область инициации репликации, ген HIS4 дрожжей; фрагмент 5′-некодирующей области дрожжевого гена АОХ1 размером 0,95 т.п.о., содержащий область, обеспечивающую активацию транскрипции этого гена в присутствии метанола в качестве источника углерода в культуральной среде; препрообласть гена MF дрожжей Saccharomyces cerevisiae размером 0,27 т.п.о., обеспечивающую секрецию гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, в культуральную среду; фрагмент гена АОХ1 размером 0,33 т.п.о., содержащий область терминации транскрипции этого гена; фрагмент 3′-нетранслируемой области гена АОХ1 размером 0,76 т.п.о.;

– XhoI-Bsu36I – фрагмента размером 1749. п.о., содержащего кодирующую часть гена альбумина плазмы крови человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, и терминирующего кодона;

– Bsu36I-EcoRI – фрагмента размером 399 п.о., содержащего кодирующую часть гена ИЛ-2 человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид; содержащая уникальные сайты распознавания следующих рестриктаз: XhoI – 1193 п.о.; EcoRI – 3341 п.о.; Bst1107I – 7925 п.о.; PvuI – 9426 п.о.; AatII – 9978 п.о.

Схема плазмиды pPIC9HAbIL-2 с рестрикционной картой изображена на Фиг.1. Общий размер плазмиды 10148 п.о.

Согласно изобретению также предложен способ конструирования плазмиды pPIC9HAbIL-2. Схема указанного способа приведена на Фиг.2.

В предлагаемом способе ген альбумина плазмы крови человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, и терминирующего кодона, получают при помощи обратной ПЦР с использованием матрицы мРНК, полученной из гепатоцитов человека, прямого праймера SEQ ID NO:1, содержащего сайт для рестриктазы XhoI, обратного праймера SEQ ID NO:2, содержащего сайт для рестриктазы MstII; ген ИЛ-2 человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, получают при помощи ПЦР с использованием матрицы плазмиды pJDB(MSIL), прямого праймера SEQ ID NO:3, содержащего сайт для рестриктазы Bsu36I, обратного праймера SEQ ID NO:4, содержащего сайт для рестриктазы EcoRI; полученный ген альбумина плазмы крови человека обрабатывают рестриктазами XhoI и MstII, полученный ген ИЛ-2 человека обрабатывают рестриктазами Bsu36I и EcoRI и лигируют с плазмидой рРIС9, предварительно обработанной рестриктазами XhoI и EcoRI, затем лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli и отбирают клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду pPIC9HAbIL-2.

Плазмиду pJDB(MSIL) (Мясников и др. А.с. SU 17703359 A1, МКИ С12N 15/26, 1/19. – 1989) используют в качестве матрицы для амплификации гена ИЛ-2 человека при помощи ПЦР. Последовательность фрагмента плазмиды pJDB(MSIL), использованная в качестве матрицы в ПЦР для получения гена ИЛ-2 человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, представлена как SEQ ID NO:6. Курсивом приведена последовательность гена ИЛ-2 человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид. Выделены последовательности, комплементарные прямому праймеру (SEQ ID NO:3) и обратному праймеру (SEQ ID NO:4) для ПЦР. Подчеркнуты сайты для рестриктазы MstII и для рестриктазы EcoRI. В качестве прямого праймера служит олигонуклеотид 5-caagctgccttaggcttagcacctacttcaagt (SEQ ID NO:3), содержащий сайт для рестриктазы Bsu36I. В качестве обратного праймера используют олигонуклеотид 5-ggaattcttaagtcagtgttgagatg (SEQ ID NO:4), который содержит сайт для рестриктазы EcoRI. Синтезированный ген ИЛ-2 человека размером 399 п.о. выделяют при помощи электрофореза в 0,7% агарозном геле, обрабатывают рестриктазами Bsu36I и EcoRI.

Для получения гена альбумина человека применяют метод обратной ПЦР, в качестве матрицы используют мРНК, выделенную из культуры гепатоцитов человека. Последовательность мРНК из гепатоцитов человека, использованная в качестве матрицы в реакции обратной ПЦР для получения гена альбумина плазмы крови человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, и терминирующего кодона, представлена как SEQ ID NO:5. Выделены последовательности, комплементарные прямому праймеру (SEQ ID NO:1) и обратному праймеру (SEQ ID NO:2) для реакции обратной ПЦР. Подчеркнуты сайты для рестриктазы XhoI и для рестриктазы MstII. Прямым праймером является олигонуклеотид 5-ccgctcgagaaaagagatgcacacaagagt (SEQ ID NO:1), содержащий сайт для рестриктазы XhoI, обратным праймером служит олигонуклеотид 5-tgaagtaggtgctaagcctaaggcagcttg (SEQ ID NO:2), содержащий сайт для рестриктазы MstII. Синтезированный ген альбумина человека размером 1749. п.о., выделяют при помощи электрофореза в 0,7% агарозном геле, обрабатывают рестриктазами XhoI и MstII.

Полученные фрагменты ДНК, содержащие ген ИЛ-2 человека и ген альбумина человека, лигируют с плазмидой pPIC9 («Invitrogen»), предварительно обработанной рестриктазами XhoI и EcoRI.

Полученной лигазной смесью трансформируют клетки штамма DH5 Escherichia coli (F/endA1 hsdR17 (r_k ^– m_k ⁺) supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nal^r) relA1 (lacZYA-argF)U169 deoR (80dlac(lacZ)M15), с помощью рестрикционного анализа отбирают трансформанты, содержащие плазмиду pPIC9AbFN. Для доказательства идентичности гена ИЛ-2 и гена альбумина, амплифицированных при помощи ПЦР, природным аналогам проводят определение их нуклеотидной последовательности (Sanger F.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. – 1977. – V.74. – P.5463-5467).

Таким образом, плазмида pPIC9HAbIL-2 создана на основе челночного бактериально-дрожжевого интегративного вектора рРIС9 (имеется в продаже («Invitrogen»). В результате трансформации линеаризованной плазмидой и последующей гомологичной рекомбинации происходит встраивание экспрессионной кассеты в хромосому дрожжей Pichia pastoris, что обеспечивает стабильное поддержание клонированного гибридного гена, который состоит из находящихся в одной рамке считывания гена альбумина человека без терминирующего кодона и гена ИЛ-2 человека. Преимуществом такой интегративной системы экспрессии является также отсутствие в геноме дрожжей интегрантов фрагментов бактериальной ДНК и генов устойчивости к антибиотикам, что предотвращает опасность горизонтального переноса этих генов. В состав плазмиды входит ген HIS4 дрожжей, что позволяет селективно отбирать трансформантов при использовании в качестве реципиентов штаммы дрожжей с мутациями в этом гене.

Экспрессия гибридного гена, который состоит из находящихся в одной рамке считывания гена альбумина человека без терминирующего кодона и гена ИЛ-2 человека, в составе плазмиды pPIC9HAbIL-2 находится под контролем промотора гена АОХ1, содержащим области, обеспечивающие активацию транскрипции в присутствии метанола в культуральной среде, а также область инициации транскрипции. Промотор гена АОХ1 относится к числу наиболее сильных дрожжевых промоторов. Уровень экспрессии генов, находящихся под контролем АОХ1 промотора, эффективно регулируется источниками углерода. Транскрипция гена АОХ1 полностью блокирована при выращивании дрожжей на среде с глюкозой, на среде с глицерином наблюдается только базальный уровень экспрессии гена. Использование метанола в качестве единственного источника углерода значительно усиливает экспрессию гена АОХ1 и, следовательно, генов, находящихся под контролем АОХ1 промотора. Это позволяет регулировать синтез гибридного гена, который состоит из находящихся в одной рамке считывания гена альбумина человека без терминирующего кодона и гена ИЛ-2 человека в клетках дрожжей. Регулируемая экспрессия клонированного гена позволяет существенно снизить метаболическую нагрузку на клетку дрожжей. Наличие в составе плазмиды препрообласти гена MF дрожжей Saccharomyces cerevisiae обеспечивает секрецию синтезированного гибридного белка, который состоит из альбумина человека и ИЛ-2 человека, в культуральную жидкость.

В качестве продуцента гибридного белка, который состоит из альбумина человека и ИЛ-2 человека, используют штамм PS107(pPIC9HAbIL-2). Штамм PS107(pPIC9HAbIL-2) получен трансформацией штамма дрожжей PS99 (his4 pep4::PHO85) плазмидой pPIC9HAbIL-2. Штамм PS99 несет мутацию в гене HIS4, что позволяет селективно отбирать трансформантов, несущих плазмиду pPIC9HAbIL-2. Мутация в гене РЕР4 приводит к отсутствию активности протеаз А и В, а также карбоксипептидазы Y в клетках дрожжей, что сопровождается повышением стабильности гетерологичных рекомбинантных белков (Hisch H.H. et al. In: Walton E.F., Yarranton G.T., Eds., Molecular and Cell Biology of Yeast. – 1989. – P. 134-200).

Штамм дрожжей Pichia pastoris PS107(pPIC9HAbIL-2) характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки округлой, слегка овальной формы, размером 5-10 мкм, часть клеток имеет на поверхности почки или соединена с дочерними клетками.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на полной органической среде YEPD – 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы или 1% глицерина.

Кроме того, клетки хорошо растут на минеральной среде SC: 1,34% Yeast Nitrogen Base («Difco», США), а также на других синтетических средах для дрожжей, содержащих в качестве источника углерода глюкозу (2%) или глицерин (1%).

Клетки штамма отличаются слабым ростом на средах, содержащих в качестве источника углерода метанол (0,5%-1%).

При росте на твердых средах клетки образуют гладкие, круглые колонии с матовой поверхностью, светло-кремового цвета, край неровный.

При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную суспензию. Культура имеет характерный запах метилотрофных дрожжей.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах от 4 до 37°С. Оптимальной температурой выращивания является 30°С. При росте в аэробных условиях клетки незначительно закисляют среду. Оптимум рН для роста составляет 4,5-6,5.

В качестве источника углерода клетки могут использовать многие простые соединения, такие как: глюкоза, глицерин, метанол.

В качестве источника азота клетки могут использовать минеральные соли в аммонийной форме, аминокислоты, мочевину.

Клетки способны к аэробному и анаэробному росту.

Существенными признаками штамма является отсутствие потребности в гистидине.

Способ получения EcoRI-XhoI – фрагмента плазмидной ДНК рРIС9 проиллюстрирован следующим примером.

ПРИМЕР 1.

Клетки бактерий Escherichia coli, содержащие плазмиду рРIС9, выращивают при 37°с в течение ночи в 1 л питательной среды LB (1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% хлористого натрия), содержащей ампициллин в концентрации 50 мг/л. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут при 4°С, суспендируют в 20 мл 25 мМ трис-хлоридного буфера (рН 8,0), содержащего 10 мМ ЭДТА и 50 мМ глюкозы, добавляют 30 мг лизоцима и инкубируют 10 минут при комнатной температуре. Далее добавляют 40 мл 0,2 М гидроокиси натрия, содержащей 1% додецилсульфата натрия, осторожно перемешивают и инкубируют в течение 10 минут при 4°С. Раствор нейтрализуют добавлением 30 мл 3 М ацетата натрия (рН 5,0) и выдерживают в течение 10 минут при 4°С. После этого центрифугируют при 14000 об/мин в течение 40 минут при 4°С. К супернатанту добавляют 0,6 объема изо-пропилового спирта, выдерживают 20 минут при комнатной температуре и центрифугируют при 14000 об/мин в течение 20 минут при 20°С. Полученный осадок промывают 70% этиловым спиртом, высушивают в вакууме и растворяют в 4 мл дистиллированной воды. Далее добавляют 4,2 г хлористого цезия и 0,36 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Полученный раствор выдерживают в течение 1 часа при 4°С, затем центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 минут. Супернатант центрифугируют при 70000 об/мин в течение 16 часов в центрифуге TL100 («Beckman»). После центрифугирования отбирают полосу плазмидной ДНК (нижнюю из двух флюоресцирующих в ультрафиолетовом свете полос), дважды экстрагируют бромистый этидий равным объемом изо-амилового спирта, разбавляют в два раза дистиллированной водой и осаждают плазмидную ДНК двумя объемами этилового спирта и 1/15 объема 3 М ацетата натрия (рН 5,0). Осадок собирают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 минут, промывают 70% этиловым спиртом и растворяют в 0,5-1 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-хлоридный буфер, рН 8,0, содержащий 1 мМ ЭДТА). Концентрацию плазмидной ДНК определяют по поглощению раствора при длине волны 260 нм. Чистоту препарата контролируют при помощи электрофореза в 0,7% агарозном геле в буфере ТВЕ (0,1 М трис-боратный буфер, рН 8,3, содержащий 1 мМ ЭДТА).

Гидролиз полученной плазмиды рРIС9 рестриктазами XhoI и EcoRI проводят в 10 мМ трис-хлоридном буфере (рН 7,5), содержащем 50 мМ хлористого натрия, 10 мМ хлористого магния и 1 мМ дитиотреитол. К 5 мкг плазмидной ДНК в объеме 20 мкл добавляют по 5 ед. каждой рестриктазы, после чего пробу инкубируют в течение 25 часов при 37°С.

Реакционную смесь вносят в лунки в 0,7% агарозного геля в буфере ТВЕ и проводят разделение полученных фрагментов ДНК. По окончании разделения вырезают полоску геля, содержащую фрагмент ДНК размером 8 т.п.о., соответствующий линеаризованному XhoI-EcoRI фрагменту плазмиды рРIС9. Выделение ДНК из агарозного геля проводят по методике, разработанной фирмой QIAGEN. Полоску геля с фрагментом ДНК помещают в пробирку и добавляют раствор QX1 (300 мкл на 100 мг геля), добавляют реактив QIAEX (10 мкл на 5 мкг ДНК) и инкубируют при 50°С в течение 10 минут, периодически перемешивая. Далее центрифугируют 30 секунд при 15000 об/мин, супернатант отбрасывают, осадок дважды экстрагируют растворами QX2 и QX3, удаляют супернатант центрифугированием при 15000 об/мин в течение 30 секунд. Осадок высушивают на воздухе, растворяют в 20 мкл буфера ТЕ, центрифугируют 30 секунд при 15000 об/мин, супернатант переносят в новую пробирку.

Способ получения гена ИЛ-2 человека проиллюстрирован следующим примером.

ПРИМЕР 2.

Ген ИЛ-2 человека амплифицируют при помощи ПЦР. В качестве матрицы используют плазмиду pJDB(MSIL). Выделение плазмиды pJDB(MSIL) проводят в условиях, аналогичных для плазмиды рРIС9.

К 0,1 мкг плазмиды pJDB(MSIL), растворенной в 5 мкл буфера ТЕ, добавляют 1 мкл 0,5 М NaOH и нагревают при 85° в течение 3 минут. Затем пробу быстро переносят в лед, добавляют 1 мкл 0,5 М HCl и далее используют в ПЦР.

В качестве прямого праймера служит олигонуклеотид 5′-caagctgccttaggcttagcacctacttcaagt, содержащий сайт для рестриктазы Bsu36I. В качестве обратного праймера используют олигонуклеотид 5′-ggaattcttaagtcagtgttgagatg, который содержит сайт для рестриктазы EcoRI. Проба для ПЦР содержит 5 мкл матрицы, 30 рМ каждого праймера, 10 мкл 10-кратного раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), содержащего 1,25 мМ каждого дНТФ (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), 10 мкл 10-кратного буфера для ПЦР (100 mM KCl, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 200 mM Трис-HCl, pH 8,8, 20 mM MgSO₄, 1% тритон Х-100). В пробу добавляется дистиллированная Н₂O до конечного объема 100 мкл.

Далее пробу прогревают 5 мин при 95°С, охлаждают, добавляют 2,5 ед. Вент-ДНК-полимеразы («BioLabs») и проводят 50 циклов ПЦР в следующих условиях: 1 мин при 95°С (плавление цепей ДНК), 1 мин при 46°С (отжиг праймеров), 1 мин при 72°С (полимеразная реакция). После окончания ПЦР пробу инкубируют при 72°С 5 мин.

Реакционную смесь вносят в лунки в 0,7% агарозного геля в буфере ТВЕ и проводят разделение полученных фрагментов ДНК. По окончании разделения вырезают полоску геля, содержащую фрагмент ДНК размером 399 п.о., соответствующий гену ИЛ-2 человека. Выделение ДНК из агарозного геля проводят по описанной выше методике фирмы QIAGEN. Гидролиз фрагмента ДНК, содержащего амплифицированный ген ИЛ-2 человека, рестриктазами Bsu36I и EcoRI проводят в условиях, описанных для расщепления плазмиды рРIС9.

Способ получения гена альбумина человека проиллюстрирован следующим примером.

ПРИМЕР 3.

Ген альбумина человека получают методом обратной полимеразной цепной реакции, используя в качестве матрицы мРНК, полученную из клеток печени человека. Клетки печени человека (банк клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург) культивируют в среде Игла, содержащей 2-глутамин и 10% эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота, до плотности 0,5-1,0×10⁵ клеток/мл. Снимают клетки, используя 0,02% версен, содержащий химотрипсина (0,1 мг/мл), дважды промывают клетки средой Игла, содержащей 2-глутамин, 10% эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота и осаждают клетки центрифугированием (800 об/мин, 10 мин). Далее клетки дважды промывают изотоническим раствором, свободным от РНКаз и ресуспендируют в 100 мкл раствора, содержащего 4 М гуанидин тиоционат, 25 мМ цитрат натрия, pH 7.0, 0,5% саркозил натрия, 0,1 М 2-меркаптоэтанол и 0,3 М ацетата натрия (рН 4). Полученную смесь встряхивают на «Vortex» в течение 10 мин, центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин, отбирают водную фазу, добавляют к ней равный объем смеси фенол:хлороформ (1:1), уравновешенной буфером, содержащим 25 мМ цитрат натрия, рН 7.0, 0,5% саркозил натрия, 0,1 М 2-меркаптоэтанол и 0,3 М ацетата натрия (рН 4), встряхивают на «Vortex» в течение 5 мин, центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин. Отбирают водную фазу и повторяют экстракцию смесью фенол:хлороформ, центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин. К водной фазе добавляют равный объем изо-пропилового спирта. Для осаждения помещают смесь на -20°С на ночь. После центрифугирования (12000 об/мин, 5 мин) осадок промывают холодным 70% этанолом, подсушивают и растворяют в 20 мкл деионизованной воды, свободной от РНКаз.

Полученную РНК используют в качестве матрицы для синтеза кДНК гена альбумина человека при помощи обратной ПЦР с использованием Tth-полимеразы. Прямым праймером служит олигонуклеотид 5′-ccgctcgagaaaagagatgcacacaagagt, содержащий сайт для рестриктазы XhoI, обратным праймером служит олигонуклеотид 5′-tgaagtaggtgctaagcctaaggcagcttg, содержащий сайт для рестриктазы MstII. Проба для проведения ПЦР содержит 1 мкл матрицы (примерно 5 мкг), 30 рМ каждого праймера, 10 мкл 10-кратного раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), содержащего 1,25 мМ каждого дНТФ (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), 10 мкл 10-кратного буфера (500 mM NaCl, 500 тМ Трис-HCl, рН 9,0, 100 mM MgCl₂), 5 ед. Tth-полимеразы. В пробу добавляется дистиллированная Н₂O до конечного объема 50 мкл. Стадию обратной ПЦР проводят при 70°С в течение 3 мин, затем 50 мин при 42°С и 2 мин при 94°С.

Полученную кДНК гена альбумина человека используют как матрицу для амплификации этого гена при помощи ПЦР, которую проводят в следующем режиме: 30 с при 94°С, 30 с при 58°С и 30 с при 72°С. Повторяют этот цикл 45 раз, после чего инкубируют пробу при 72°С 5 мин. Синтезированный ген альбумина человека размером 1749 п.о. выделяют из агарозного геля по описанной выше методике фирмы QIAGEN. Гидролиз фрагмента ДНК, содержащего амплифицированный ген альбумина человека рестриктазами XhoI и MstII проводят в условиях, описанных для расщепления плазмиды рРIС9.

Способ получения плазмиды pPIC9HAbIL-2 проиллюстрирован следующим примером.

ПРИМЕР 4.

Для получения плазмиды pPIC9HAbIL-2 проводят дотирование XhoI-EcoRI фрагмента плазмиды рРIС9 (получение которого описано в примере 1), Bsu36I-EcoRI фрагмента гена ИЛ-2 человека (получение которого описано в примере 2) и XhoI-MstII фрагмента гена альбумина человека (получение которого приведено в примере 3).

Для этого смешивают эквимолярные количества ДНК плазмиды и амплифицированных генов в 10 мкл 40 мМ трис-хлоридного буфера (рН 7,8), содержащего 10 мМ дитиотреитола, 10 мМ хлористого магния, 0,5 мМ АТФ, добавляют 5 ед. ДНК-лигазы фага Т4 и инкубируют при 14°С в течение ночи.

Полученной лигазной смесью трансформируют клетки штамма DH5 Escherichia coli (F’/end A1 hsdR17 (r_k ^– m_k ⁺) supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nal^r) relA1 (lacZYA-argF)U169 deoR (80dlac(lacZ)M15). Для этого клетки Escherichia coli выращивают в 100 мл среды LB при 37°С до достижения культурой густоты клеточной суспензии, соответствующей 0,4-0,6 ед. оптической плотности при длине волны 550 нм. Клеточную суспензию охлаждают в ледяной бане, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 минут при 4°С. Клетки супендируют в 100 мл 10 мМ хлористого натрия, собирают центрифугированием в тех же условиях. Далее клетки суспендируют в 50 мл 75 мМ хлористого кальция, выдерживают в ледяной бане в течение 40 минут, осаждают центрифугированием в тех же условиях и суспендируют в 1 мл 75 мМ хлористого кальция. К суспензии компетентных клеток добавляют глицерин до конечной концентрации 15%, разделяют на аликвоты и хранят при -70°. Перед трансформацией суспензию компетентных клеток размораживают в ледяной бане, добавляют лигазную смесь и инкубируют в ледяной бане в течение 40 минут. Далее клетки подвергают действию теплового шока при 42°С в течение 2 минут, после чего инкубируют в 1,5 мл среды LB при 37°С в течение 1 часа. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут и высевают на чашки Петри со средой LB, содержащей 2% агара и 50 мг/л ампициллина. Чашки инкубируют при 37°С в течение 12-16 часов.

Из выросших отдельных клонов трансформантов выделяют плазмидную ДНК при помощи методики, использованной для получения плазмиды рРIС9, за исключением того, что клетки Escherichia coli выращивают в 10 мл LB, и, соответственно, объемы всех растворов уменьшают в 100 раз. Кроме того, вместо стадии центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия проводят обработку ДНК панкреатической РНКазой. Для этого нуклеиновые кислоты, осажденные изо-пропиловым спиртом, растворяют в 100 мкл буфера ТЕ, добавляют 10 мкл раствора РНКазы (1 мг/мл) и инкубируют 30 минут при 37°С.

Далее проводят гидролиз полученной плазмидной ДНК рестриктазами EcoRI и XhoI или BglII. При рестрикции искомой плазмиды pPIC9HAbIL-2 и последующем электрофорезе в 0,7% агарозном геле в первом случае обнаруживаются фрагменты 2,148 п.о. и 8,0 т.п.о., во втором – фрагменты 1911 п.о., 2410 п.о. и 5827 п.о. Из выявленного таким образом клона препаративно выделяют плазмиду pPIC9HAbIL-2 так же, как описано для плазмиды рР1С9, и гидролизуют рестриктазами Bst1107I и AatII в условиях, описанных для расщепления плазмиды рРIС9.

Bst1107I-AatII фрагмент плазмиды pPIC9HAbIL-2, размером 8,1 т.п.о., выделяют по описанной выше методике фирмы QIAGEN и используют его для трансформации клеток дрожжей, как описано в примере 5.

ПРИМЕР 5.

Для получения штамма дрожжей Pichia pastoris – продуцента гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, клетки дрожжей штамма PS99 трансформируют плазмидой pPIC9HAbIL-2.

Клетки дрожжей выращивают в 100 мл среды YEPD при 30°С до достижения культурой оптической плотности, соответствующей 2-4 ед. поглощения при длине волны 600 нм. Клетки дважды промывают стерильной водой, после чего суспендируют в 0,3 мл 100 мМ раствора ацетата лития и инкубируют при 301°С в течение 30 минут. К 50 мкл полученной суспензии клеток добавляют 0,1-1 мкг плазмидной ДНК, 50 мкг ДНК спермы лосося, предварительно денатурированной нагреванием (10 минут при 100°) и 0,3 мл раствора 100 мМ ацетата лития, содержащего 40% полиэтиленгликоля 4000. Далее пробу инкубируют 30 минут при 30°С и 20 минут при 42°С, помещают на 15 секунд в ледяную баню и центрифугируют 10 секунд при 10000 об/мин. Клетки суспендируют в 1 мл стерильной воды и высевают на твердую среду SC. Клоны трансформантов вырастают через 2-3 суток. Выросшие клоны пересевают на чашки со средой SC, содержащей 2% глюкозу, отдельными колониями, затем перепечатывают на среду ММ (1,34% Yeast Nitrogen Base («Difco», США), 0,5% метанола, 2% агара («Difco», США) для отбора трансформантов, отличающихся слабым ростом на среде с метанолом, что свидетельствует об интеграции гибридного гена, состоящего из гена ИЛ-2 человека и гена альбумина человека, в локус AOXI (фенотип Met^s).

Для анализа продукции гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, клетками трансформантов фенотипа Met^s их выращивают при 30°С в 100 мл жидкой среды BMGY (2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 1% глицерина, 10 мл 1 М калий-фосфатного буфера, рН 6,0, 1,34% Yeast Nitrogen Base («Difco», США) до стационарной фазы роста в течение 2 суток. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут, супернатант сливают и переносят всю биомассу в 20 мл жидкой среды BMMY (2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 0,5% метанола, 10 мл 1 М калий-фосфатного буфера, рН 6,0, 1,34% Yeast Nitrogen Base («Difco», США) для индукции экспрессии гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека. Индукцию проводят при 30°С в течение 4 суток. По окончании индукции культуральную среду отделяют от клеточной биомассы центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут. В культуральной среде определяют содержание гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и последующей гибридизации с антителами к ИЛ-2 человека. Разделение белков проводят в 15% полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ трис, 192 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, рН 8,3; буфер для геля: 375 мМ трис-хлоридный буфер, рН 8,8). Параллельно проводят разделение белков контрольного штамма, выращенного в идентичных условиях. В качестве стандартов молекулярной массы используют -галактозидазу (116,0 кДа), бычий сывороточный альбумин (66,2 кДа), овальбумин (45,0 кДа), лактатдегидрогеназу (35,0 кДа), эндонуклеазу рестрикции Bsp98I (25,0 кДа), р-лактоглобулин (18,4кДа), лизоцим (14,4 кДа). По окончании электрофореза белки ренатурируют, выдерживая гели 15 минут в 10 мМ трис-хлоридном буфере (рН 7,5), содержащем 4 М мочевину, 20 мМ ЭДТА, и переносят на нитроцеллюлозную мембрану в 25 мМ трис-192 мМ глициновом буфере (рН 8,3), содержащем 20% метилового спирта, при 30-40 В, в течение 1,5 часов. Далее мембрану выдерживают в буфере TBST (10 мМ трис-хлоридный буфер (рН 8,0), содержащего 150 мМ хлористого натрия, 0,05% твин-20, 1% бычьего сывороточного альбумина) в течение 2 часов при 37°С. Затем помещают мембрану в тот же буфер, содержащий разведенные в 500 раз кроличьи поликлональные антитела к ИЛ-2 человека, меченные биотином («NatuTec» Германия), и инкубируют 2 часа при 37°С. Далее трижды промывают мембрану буфером TBST и инкубируют 1 час при 37°С с разбавленным в 3000 раз конъюгатом стрептавидина со щелочной фосфатазой («Силекс М», Москва). После отмывки мембраны буфером PBST (58 мМ двузамещенного фосфата натрия, 17 мМ однозамещенного фосфата натрия, 68 мМ хлористого натрия, 0,1% твин-20) добавляют раствор субстратов для щелочной фосфатазы 0,56 мМ BCIP (5-бром -4-хлор-3-индолилфосфата р-толуидиновая соль), 0,48 мМ NBT (нитротетрозолиум синий) в 10 мМ трис-хлоридном буфере (рН 9,2), содержащем 59,3 мМ хлористого магния. Параллельно окрашивают гели 0,15% раствором кумасси G250 в 25% изо-пропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывают в 10% уксусной кислоте. При сравнении спектра белков двух штаммов у штамма PS107(pPIC9HAbIL-2) обнаруживают появление дополнительной белковой полосы с молекулярной массой 82 кДа, дающей четкую положительную реакцию с антителами к ИЛ-2 человека. Молекулярная масса этого секретируемого белка совпадает с теоретически ожидаемой молекулярной массой гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека. Уровень синтеза гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека определяют, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой стандартного белка.

Согласно полученным данным клетки дрожжей штамма PS107 (pPIC9HAbIL-2) синтезируют и секретируют около 5 мг гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, на литр культуры дрожжей. Гибридный белок обладает биологической активностью, характерной для ИЛ-2 человека.

Суммируя вышесказанное можно заключить, что полученный штамм дрожжей Pichia pastoris PS107 (pPIC9HAbIL-2) синтезирует и секретирует гибридный белок, состоящий из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, в количестве, достаточном для его очистки в лабораторном масштабе. В результате такой очистки могут быть получены препараты гибридного белка, пригодные для исследования его биологических свойств и терапевтической ценности. Преимуществом данного продуцента является большая стабильность получаемого рекомбинантного белка, содержащего рИЛ-2 человека, по сравнению с продуктом штаммов-прототипов (ВКПМ Y-791, ВКПМ Y-3079), что связано с гликозилированием его молекулы и сшивкой с альбумином плазмы крови человека, а также упрощенная процедура очистки, обусловленная секрецией рекомбинантного белка.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмида pPIC9HAbIL-2, обеспечивающая биосинтез и секрецию гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, трансформированными ею клетками дрожжей, имеющая размер 10148 п.о. и состоящая из следующих элементов:

EcoRl-Xho1 – фрагмента плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектора рР1С9 размером 8,00 т.п.о., ограниченного сайтами рестрикции EcoRl-Xho1 и включающего бактериальный ген устойчивости к ампициллину; бактериальную область инициации репликации; ген HIS4 дрожжей; фрагмент 5-некодирующей области дрожжевого гена АОХ1 размером 0,95 т.п.о., содержащий область, обеспечивающую активацию транскрипции этого гена в присутствии метанола в качестве источника углерода в культуральной среде; препрообласть гена MF дрожжей Saccharomyces cerevisiae размером 0,27 т.п.о., обеспечивающую секрецию гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, в культуральную среду; фрагмент гена АОХ1 размером 0,33 т.п.о., содержащий область терминации транскрипции этого гена; и фрагмент 3-нетранслируемой области гена АОХ1 размером 0,76 т.п.о.; Xho1-Bsu36I – фрагмента размером 1749 п.о., содержащего кодирующую часть гена альбумина плазмы крови человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, и терминирующего кодона;

Bsu36I-EcoR1 – фрагмента размером 399 п.о., содержащего кодирующую часть гена ИЛ-2 человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид.

2. Штамм дрожжей Pichia pastoris PS107(pPIC9HAbIL-2) – продуцент гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, представляющий собой штамм Pichia pastoris PS99 (his4 pep4::PHO85), трансформированный плазмидой pPIC9HAbIL-2 по п.1.

3. Способ конструирования рекомбинантной плазмиды pPIC9HAbIL-2 по п.1, при котором ген альбумина плазмы крови человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, и терминирующего кодона, получают при помощи обратной ПЦР с использованием матрицы мРНК, полученной из гепатоцитов человека, прямого праймера SEQ ID NO:1, содержащего сайт для рестриктазы Xho1, обратного праймера SEQ ID NO:2, содержащего сайт для рестриктазы MstII; ген ИЛ-2 человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, получают при помощи ПЦР с использованием матрицы плазмиды pJDB(MSIL), прямого праймера SEQ ID NO:3, содержащего сайт для рестриктазы Bsu36I, обратного праймера SEQ ID NO:4, содержащего сайт для рестриктазы EcoR1; полученный ген альбумина плазмы крови человека обрабатывают рестриктазами Xhol и MstII; полученный ген ИЛ-2 человека обрабатывают рестриктазами Bsu36I и EcoR1;

лигируют гены альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, обработанные как указано выше, с плазмидой рР1С9, предварительно обработанной рестриктазами Xho1 и EcoR1, и полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli и отбирают клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду pPIC9HAbIL-2.

РИСУНКИ

PC4A – Регистрация договора об уступке патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Прежний патентообладатель:

Общество с ограниченной ответственностью “БИОТЕХ”

(73) Патентообладатель:

Смирнов Михаил Николаевич

Договор № РД0032388 зарегистрирован 07.02.2008

Извещение опубликовано: 20.03.2008 БИ: 08/2008