Патент на изобретение №2315101
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/КАЛИФОРНИЯ/ 04/6 (Н3N2) И ДОНОР АТТЕНУАЦИИ А/ЛЕНИНГРАД/134/17/К7/57 (Н2N2) ДЛЯ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
(57) Реферат:
Изобретение относится к области вирусологии и медицины. Вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) – реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса А/Калифорния/7/04 (H3N2) с клонированным холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2). Штамм А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2), полученный для этого, является донором аттенуации, безвредным для людей, свойства которого дают возможность гарантированно получать реассортантные вакцинные штаммы из вновь появляющихся эпидемических вирусов. Штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 33°С. Штамм характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал ген, кодирующий основной поверхностный антиген вируса (гемагглютинин), от эпидемического вируса и остальные семь генов, кодирующих негликозилированные белки и поверхностный белок нейраминидазу, от донора аттенуации. Штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) ареактогенен для взрослых и для детей при интраназальном введении. Изобретение может быть использовано в медицине. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых и детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма А/17/Калифорния/04/6 (H3N2). Этот вакцинный штамм был получен с помощью созданного для этой цели донора аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2). Известный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Панама/99/242 (H3N2) – прототип [Патент РФ №2248395 от 11.07.2003. – Опубл. БИ 2005. – №8] – утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, аналогичным вирусу А/Калифорния/7/04 (H3N2). Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для взрослых и детей актуальной антигенной разновидности на основе современного эпидемического вируса А/Калифорния/7/04 (H3N2). Такой штамм создан – это вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2). Он получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Калифорния/7/04 (H3N2) с холодоадаптированным температурочувствительным донором аттенуации с последующей селекцией при пониженной до 25°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Для получения вакцинного штамма в качестве донора аттенуации был использован новый, созданный методом клонирования штамм А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2). Известен донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. – СПб.: Наука. – 1994. – 151 с.]. Указанный штамм А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) является прототипом созданного нами штамма А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2). Одним из этапов подготовки вакцинного штамма является клонирование смеси реассортантов в куриных эмбрионах методом предельных разведений, и вакцинный реассортант наследует гены, кодирующие внутренние белки вируса, от какого-то одного клона, содержащегося в гетерогенной популяции донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Некоторые клоны из этой популяции близки по набору мутаций к гиператтенуированному донору аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2), ранее используемому при подготовке живой гриппозной вакцины для детей [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. – СПб.: Наука. – 1994. – 151 с.]. Так как “детские” вакцинные штаммы, подготовленные на этом доноре, являлись низкоиммуногенными для взрослых людей, то существует вероятность того, что вакцинный штамм, унаследовавший внутренние гены от клона из популяции донора А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), который близок по набору мутаций донору А/Ленинград/134/47/57 (H2N2), также окажется низкоиммуногенным. Таким образом, используя в качестве донора аттенуации гетерогенный А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), невозможно заранее предугадать, какой из клонов передаст в геном вакцинного штамма гены, кодирующие внутренние белки вируса. Поэтому для получения вакцинного штамма А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) необходимо было иметь в качестве донора аттенуации чистый клон из популяции донора А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Клон А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) был получен с помощью клонирования донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) в развивающихся куриных эмбрионах и содержит 7 мутаций во внутренних генах: РВ2 (Val-478-Leu), РВ1 (Lys-265-Asn и Val-591-Ile), PA (Leu-28-Pro и Val-341-Leu), M1 (Ile-15-Val) и NS2 (Met-100-Ile). У клона А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) отсутствует мутация в гене М2 (Ala-86-Thr), свойственная части популяции донора А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Клон А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) был изолирован из популяции донора А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), который является аттенуированным для людей, так как обладает свойствами температурочувствительности и холодоадаптированности. Полученный нами клонированный донор аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) также обладает признаками температурочувствительности и холодоадаптированности. Поэтому клонированный донор также должен быть аттенуированным для человека. Пример выполнения Клон А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) был получен в результате двукратного клонирования донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) предельными разведениями от 10-7 до 10-10 в развивающихся куриных эмбрионах. Каждым разведением вируса было заражено по 20 куриных эмбрионов. Аллантоисную жидкость единственного положительного в реакции гемагглютинации эмбриона, зараженного разведением вируса 10-9, использовали для второго раунда клонирования. После второго раунда клонирования был выбран клон К7, также полученный из разведения 10-9. Клонированный донор аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) характеризовался признаками температурочувствительности и холодоадаптированности, характерными для неклонированного донора А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Он обладал пониженным уровнем репродукции в куриных эмбрионах при 40°С (RCT40, разница в активностях репродукции клона при 33 и 40°С составляла 7,7 Ig ЭИД50/0,2 мл) и активно размножался при температуре 25°С (RCT25, разница в репродукциях при 32 и 25°С составляла 2,9 Ig ЭИД50/0,2 мл). Таким образом по этим двум признакам клонированный вирус не отличался от неклонированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (таблица 1). Аттенуацию клонированного донора оценивали по интенсивности его репродукции в респираторном тракте (носовых ходах и легких) хорьков в сравнении с неклонированным донором А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и вирусом «дикого» типа А/Ленинград/134/57 (H2N2). Репродукция в носовых ходах хорьков всех исследованных вирусов колебалась в пределах 3,2-5,6 Ig ЭИД50/мл/г. «Дикий» вирус активно репродуцировался в легких. Отмечен сниженный уровень репродукции в легких хорьков неклонированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) по сравнению с «диким» вирусом (1,7-1,8 Ig ЭИД50/мл/г против 3,9-4,1 Ig ЭИД50/мл/г соответственно). Клонированный донор А/Ленинград/134/17/К757 (H2N2) из легких хорьков не выделялся вообще, что свидетельствовало о его высокой аттенуации для хорьков (таблица 1). На фиг.1 представлен ПЦР-рестрикционный анализ ДНК-фрагментов М2 гена А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) и его «дикого» предшественника – вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2). 1-я дорожка – ДНК маркер молекулярного веса IX; 2-я, 4-я и 6-я дорожки – А/Ленинград/134/57 (H2N2); 3-я, 5-я и 7-я дорожки – клон А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2); 8-я дорожка – неклонированный донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), 9-я дорожка-донор аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2). Видно, что обработанная рестриктазой Fok I ДНК-копия М2 гена вируса А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) имеет дополнительную полосу, характерную для «дикого» вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2) (8-я дорожка), что подтверждает данные литературы о гетерогенности неклонированного донора в этой позиции М2 гена. В таблице 2 представлены результаты анализа всех значащих мутаций в геноме нового клонированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) в сравнении с неклонированными донорами А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) и их «диким» предшественником – вирусом А/Ленинград/134/57 (H2N2). Таким образом, установлено, что заявляемый донор аттенуации имеет семь значащих мутаций во внутренних генах: РВ2 (Val-478-Leu), РВ1 (Lys-265-Asn и Val-591-Ile), PA (Leu-28-Pro и Val-341-Leu), M1 (Ile-15-Val) и NS2 (Met-100-Ile). Вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Калифорния/7/04 (H3N2) с клонированным холодоадаптированным температурочувствительным донором аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) с последующей селекцией при пониженной до 25°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33 и 40°С составляет 7,5 Ig ЭИД50/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33 и 25°С равна 3,5 Ig ЭИД50/0,2 мл). Ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма – гемагглютинин (НА) – в РТГА идентичен вирусу А/Калифорния/7/04 (H3N2), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. На фиг.2 в качестве примера представлена рестрикция ДНК-копии фрагмента гена РВ2 эндонуклеазой Mse I. 1-я дорожка – ДНК маркер молекулярного веса; 2-я, 5-я и 8-я дорожки – донор аттенуации; 3-я и 7-я дорожки – эпидемический вирус А/Калифорния/7/04 (H3N2); 4-я и 6-я дорожки – кандидат в вакцинные штаммы А/17/Калифорния/04/6 (H3N2). В РВ2 гене донора аттенуации в позиции нуклеотида 1459 имеется замена G Результаты рестрикционного анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) представлены в таблице 3. Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Калифорния/7/04 (H3N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации. Морфология штамма – полиморфная, типичная для вируса гриппа. ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34°С в течение 48 часов – 8,0 Ig ЭИД50/0,2 мл. Гемагглютинирующая активность – 1:1024. Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз). Пример получения вакцинного штамма А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) представлен в прилагаемом паспорте. ПАСПОРТ ШТАММА 1. Название штамма – А/17/Калифорния/04/6 (H3N2). 2. Серия – серия 1. 3. Метод получения – реассортация; характеристика родительских вирусов: а) эпидемический вирус – А/Калифорния/7/04 (H3N2); б) донор аттенуации – А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2); 4. Количество пассажей – 5 в процессе реассортации. 5. Характеристика штамма: а) оптимальные условия репродукции – 33°С, 48 часов; б) гемагглютинирующая активность – 1:1024; в) инфекционная активность – 8,0 Ig ЭИД50/0,2 мл; г) чувствительность к ингибиторам – ингибиторочувствительный в РТГА с нормальной лошадиной сывороткой; д) разность в показателях инфекционной активности при 33 и 40°С – 7,5 Ig ЭИД50/0,2 мл; е) разность в показателях инфекционной активности при 33 и 25°С – 3,5 Ig ЭИД50/0,2 мл; ж) структура генома реассортанта: – гены от эпидемического вируса – НА; – гены от донора аттенуации – РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS, NA. 6) Характеристика штамма после лиофилизации: а) дата лиофилизации – 11.04.2005; б) объем материала в ампуле – 1,0 мл; в) количество доз в ампуле – 4; г) инфекционная активность – 7,5 Ig ЭИД50/0,2 мл; д) гемагглютинирующая активность – 1:256. 7. Рекомендуемое разведение при вакцинации – 1:2. 8. Антигенная специфичность: а) гемагглютинина – идентичен вирусу А/Калифорния/7/04 (H3N2) по данным РТГА с иммунной крысиной антисывороткой; б) нейраминидазы – идентична вирусу А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) по данным ПЦР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов. 9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении – безвреден. 10. Бактериологический контроль: дата проведения – 04.04.2005 г.; результат – стерилен. 11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов – посторонние вирусы отсутствуют. ШТАММ А/17/КАЛИФОРНИЯ/04/6 (H3N2) АРЕАКТОГЕНЕН И ИММУНОГЕНЕН ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ ЛИЦ Пример 1. При вакцинации 51 взрослого человека интраназально реассортантным вакцинным штаммом А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) с инфекционной активностью 7,5 Ig ЭИД50/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°С) наблюдались в 1,96% случаев. Средние температурные реакции с кратковременным повышением температуры в диапозоне 37,6-38,5°С наблюдались также в 1,96% случаев. Катаральные явления отмечены в 7,84% случаев. Результаты обследования приведены в таблице 4. В получившей плацебо группе из 48 лиц температурные реакции не наблюдались. Катаральные явления отмечены в 2,08% случаев. Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 1,96%. При изучении в реакции РТГА сывороток крови 26 серонегативных вакцинированных лиц был обнаружен 4-кратный и более прирост сывороточных антител к эпидемическому штамму А/Калифорния/7/04 (H3N2) в 50% случаев. Средние геометрические титры антител во вторых сыворотках у лиц с 4-кратными и более приростами антител составили 1:34,09. Результаты серологического исследования приведены в таблице 5. Таким образом, испытания на волонтерах подтвердили, что вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) по показателям реактогенности и иммуногенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 от 26.03.2003 г. на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения. ШТАММ А/17/КАЛИФОРНИЯ/04/6 (H3N2) АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ДЕТЕЙ 3-14 ЛЕТ До 2004 г. реассортантные вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для детей и для взрослых готовили на двух разных донорах аттенуации. Вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для взрослых готовили на доноре аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. – СПб.: Наука. – 1994. – 151 с.], а вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для детей – на более аттенуированном доноре А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. – СПб.: Наука. – 1994. – 151 с.]. В 2003 г. Комитет медицинских иммунобиологических препаратов счел целесообразным рекомендовать «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую для взрослых» для иммунизации детей в возрасте 3-6 лет с внесением соответствующих изменений в «Инструкцию по применению» препарата [Инструкция по применению вакцины гриппозной аллантоисной интраназальной живой сухой. – Утверждена Главным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 16.06.2004 г.]. В этой связи нами была изучена реактогенность вакцинного штамма А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) на детях. Пример 2. Группу из 67 детей в возрасте 3-14 лет вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл реассортантным вакцинным штаммом А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) с инфекционной активностью 7,5 Ig ЭИД50/мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 30 человек получила плацебо. Результаты исследований приведены в таблице 6. В группе вакцинированных детей сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С не наблюдались. Средние реакции с кратковременным повышением температуры до 37,6-38,5°С наблюдались в 1,5% случаев. Слабые температурные реакции в диапазоне до 37,5°С также были отмечены в 1,5% случаев. Признаки интоксикации (головная боль) наблюдались у 3,0% привитых. Катаральные явления отмечены в 4,5% случаев. В группе детей, получивших плацебо, отмечены слабые температурные реакции (до 37,5°С) в 3,3% случаев. Признаки интоксикации (головная боль) наблюдались в 3,3% случаев. Катаральные явления отмечены у 6,7%. Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 1,5%. Испытания на волонтерах подтвердили, что вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) по показателям реактогенности и иммуногенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 от 26.03.2003 г. на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения. На основе вышесказанного предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста, что подтверждают результаты изучения его реактогенности для разных возрастных групп.
Формула изобретения
1. Штамм вируса гриппа А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) ГИСК №146 (Государственный институт стандартизации и контроля имени Л.А.Тарасевича), используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. 2. Штамм вируса гриппа А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2), представляющий собой клон вируса гриппа штамма А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), имеющий семь значащих мутаций во внутренних генах: РВ2 (Val-478-Leu), РВ1 (Lys-265-Asn и Val-591-Ile), PA (Leu-28-Pro и Val-341-Leu), M1 (Ile-15-Val) и NS2 (Met-100-Ile), являющийся донором аттенуации для производства вакцинного штамма по п.1
РИСУНКИ
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
T по сравнению с современными эпидемическими штаммами, приведшая к аминокислотной замене валина эпидемических вирусов на лейцин у донора аттенуации. Донор аттенуации имеет на этом участке сайт рестрикции для экзогенной рестриктазы Mse I. У эпидемических вирусов этот рестрикционный сайт отсутствует. Таким образом, обработка всех исследуемых фрагментов ДНК данным ферментом приводит к разрезанию амплифицированного участка гена РВ2 длиной 240 нуклеотидов на два более мелких фрагмента (85 и 155 нуклеотидов), если он происходит от донора аттенуации. В случае РВ2 гена от эпидемического вируса расщепления не происходит.
38,5°С)
