Патент на изобретение №2315100

(54) ЦИТОПАТОГЕННЫЙ ШТАММ ВИРУСА BOVINE VIRAL DIARRHEA – MUCOSAL DISEASE VIRUS ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ КЛИНИКИ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ – БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ – БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА У ТЕЛЯТ

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Предложены цитопатогенный штамм вируса Bovine Viral Diarrhea – Mucosal Disease Virus НИИ ККМ № V-340 для изучения клиники вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота и способ экспериментального воспроизведения вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота у телят, отличающийся тем, что суспензию штамма предложенного вируса вводят в дозе 4×10^6,5ТЦД_50/0,1мл серонегативным к вирусу телятам 3-4-месячного возраста при помощи аэрозольного генератора БГ-2. Предложенный штамм вируса вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота и способ заражения телят могут использоваться для скрининга противовирусных препаратов. 2 н.п. ф-лы.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к штаммам вируса вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота, вызывающим у серонегативных к вирусу вирусной диареи-болезни слизистых телят 3-4-месячного возраста развитие острого респираторного заболевания, и способам экспериментального заражения телят.

Известен отечественный штамм вируса вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота ВК-1, используемый для изготовления вакцин против вирусной диареи крупного рогатого скота (А. с. 1322673 СССР, А 1, С 12 N 7/00. Штамм вируса Bovine viral diarrhoea micosal Disease virus для изготовления вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота/ С.А. Жидков, Н.Н. Крюков (СССР).- №3951364/28-13; заявл.09.09.85).

К недостаткам данного штамма можно отнести то, что вирус вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота является аттенуированным, используется для изготовления вакцины против вирусной диареи – болезни слизистых крупного рогатого скота и не может вызвать развитие клинических признаков болезни.

Наиболее близким решением, принятым за прототип, к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту является штамм вируса вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота ВК-1, выделенный из селезенки больного теленка (С.А.Жидков, А.И.Лебедев, М.М.Гоголев и др. Роль вируса вирусной диареи в этиологии респираторных и желудочно-кишечных болезней телят. Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук, №3, 1995, с.50-53).

Штамм выделен в первично трипсинизированной культуре клеток почки эмбриона коровы (ПЭК), его патогенность определена на 4-6-месячных телятах, серонегативных к нему.

После экспериментального заражения штаммом ВК-1 вируса все телята заболевали на 3-7 сутки с признаками лихорадки (до 41,0°), кашля, конъюнктивитов, ринита, эрозивных поражений носа и десен и лейкопении со снижением количества лейкоцитов до 1800 кл/мл.

На вскрытии трупов животных, убитых в острой стадии болезни, основные патологоанатомические изменения локализовались в желудочно-кишечном тракте. В рубце находили крепитирующий отек стенки и кровоизлияния в слизистую оболочку с некротическими наложениями и признаки катарального воспаления в тонком отделе кишечника.

К недостаткам данного прототипа можно отнести то, что клинические признаки болезни развивались на 3-7 сутки после заражения телят в возрасте 4-6 месяцев, а патологоанатомические признаки болезни, вызванные введением вируса, локализовались, в основном, в желудочно-кишечном тракте.

Технической задачей изобретения является расширение арсенала штаммов вируса Bovine Viral Diarrhea – Mucosal Disease Virus и способ экспериментального воспроизведения вирусной диареи – болезни слизистых крупного рогатого скота у телят, включающий заражение телят при помощи аэрозольного генератора БГ-2, позволяющие изучить клинику вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота у телят.

Техническим результатом является пополнение коллекции штаммов вируса, позволяющих исследовать клинику вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота у телят.

Сущность изобретения заключается в том, что цитопатогенный штамм вируса Bovine Viral Diarrhea – Mucosal Disease, TM V-340, семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, депонированный в НИИ “Коллекция культур микроорганизмов” ГНЦ ВБ “Вектор” под номером 0604, используют для изучения клиники вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота.

Сущность изобретения заключается также в том, что для экспериментального воспроизведения вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота у телят суспензию штамма вируса вводят в дозе 4×l0^6,5ТЦД_50/0,1мл серонегативным к вирусу телятам 3-4-месячного возраста при помощи аэрозольного генератора БГ-2.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выделение цитопатогенного штамма вируса Bovine Viral Diarrhea – Mucosal Disease, TM V-340, семейства Flaviviridae, рода Pestivirus в перевиваемой линии культуры клеток КСТ.

Выделение вируса проводят в перевиваемой линии культуры клеток КСТ (коронарные сосуды теленка), выращенной микрометодом в 24-луночных планшетах для культур клеток фирмы “Costar”.

Из проб легких, полученных от больного респираторной болезнью теленка, готовят 10%-ную суспензию на стерильном фосфатно-буферном растворе, рН 7,4-7,6 с добавлением 100 ед./мл канамицина и 500 ед./мл гентамицина. Ткань растирают в стерильной ступке с битым стеклом до полной гомогенизации. Суспензию выдерживают при 4°С в течение 2-3 ч, затем центрифугируют 30 мин при 3000 об./мин. Супернатанты очищают от бактерий и грибков путем фильтрации через фильтры с диаметрами пор 0,45 и 0,22 мкм и используют для выделения вируса.

Монослой культуры клеток отмывают поддерживающей средой Игла MEM и вносят по 0,2-0,3 мл каждого испытуемого материала. Адсорбцию вируса проводят при 37°С в течение 60 мин, затем из лунок удаляют испытуемый материал и добавляют 1 мл поддерживающей питательной среды. На одну пробу используют не менее 4 лунок 24-луночного планшета. Контролем служат 4 лунки с неинфицированной культурой клеток, в которых заменяют ростовую среду поддерживающей. Зараженные и контрольные культуры клеток инкубируют при 37°С и 5% СО₂ до 7 суток, ежедневно просматривая их с целью выявления ЦПД.

С целью недопущения возможной контаминации культур клеток вирусом вирусной диареи – болезни слизистых используют сыворотку крови лошади (Биолот, Санкт-Петербург), которую добавляют в количестве 5-10% к питательной среде.

Определение инфекционной активности штамма проводят микрометодом в 96-луночных культуральных планшетах (Costar). Титр вируса выражают в ТЦД_50/0,1мл (50% тканевая цитопатическая доза).

Идентификацию выделенного вируса проводят в реакции нейтрализации при помощи моноспецифических сывороток, полученных к референтным цитопатогенным штаммам вируса вирусной диареи – болезни слизистых крупного рогатого скота ВК-1 и Oregon путем гипериммунизации кроликов по схеме (B.C. Авилов и соавт., 1979).

Параллельно вирус титруют с нормальной сывороткой. Индекс нейтрализации, равный 2 lgТЦД_50/мл и выше, свидетельствует о принадлежности изолята к вирусу вирусной диареи-болезни слизистых.

В культуре клеток КСТ на 3-5 сутки инкубирования при 37°С на уровне 3-5 пассажей вирус вызывал видимое цитопатическое действие и накапливался в титрах от 4,75 до 6,5 lg ТЦД_50/мл. ЦПД выражалось в появлении мелкоочаговой мелкозернистой дегенерации клеток, округлении, истончении, разрыве монослоя и отслоении клеток. В некоторых случаях наблюдалась вакуолизация цитоплазмы пораженных клеток. Конечная картина ЦПД выражалась в гибели клеток, отслоении в культуральную жидкость и наличии на поверхности их роста отдельных тяжей и фрагментов. В культуре клеток КСТ на 3-5 сутки инкубирования при 37°С к 3-5 пассажам изолят накапливался в титрах от 4,75 до 6,5 lg ТЦД_50/мл, а к 10-15 пассажам вызывали ЦПД на 1-е сутки культивирования при дозе заражения 1ТЦД/кл.

Вирус проявил чувствительность к хлороформу, эфиру, трипсину и прогреванию при 50°С, не обладал гемагглютинирующими и гемадсорбирующими свойствами в отношении эритроцитов морской свинки и мыши.

Электронно-микроскопическое изучение ультратонких срезов культуры клеток, зараженной вирусом и контрастированной уранилацетатом и цитратом свинца, выявляет идентичные изменения клеток и идентичные по размерам и морфологии вирусные структуры. Инфицированные клетки округлые, с гомогенным ядром, структура хроматина которого утрачена (он выглядит “спекшимся”). В некоторых ядрах просматриваются участки конденсации хроматина, характерные для апоптоза. Цитоплазма очень высокой электронной плотности содержит большое количество вакуолей разных размеров, жировые включения. Вирусные частицы сферической формы имеют диметр около 50 нм и локализуются в просвете коротких цистерн эндоплазматического ретикулума. В цитоплазме зараженных клеток обнаруживают также скопления вирусных нуклеоидов, имеющих диаметр около 30 нм, зачастую формирующих кристаллоидные структуры.

Пример 2. Способ экспериментального воспроизведения вирусной диареи – болезни слизистых крупного рогатого скота у телят при помощи цитопатогенного штамма вируса Bovine Viral Diarrhea – Mucosal Disease, TM V-340,семейства Flaviviridae, рода Pestivirus штамма для серонегативных к вирусу телят 3-4-месячного возраста.

Экспериментальное воспроизведение признаков вирусной диареи – болезни слизистых осуществляют путем заражения естественно восприимчивых к вирусу животных. Используют серонегативных к вирусу ВД-БС КРС клинически здоровых телят 3-4-месячного возраста, не менее четырех голов. Суспензию вируса вводят аэрозольно, распыляя вируссодержащую суспензию в дозе 4×10⁶ТЦД_50/0,1мл при помощи генератора аэрозоля БГ-2, который создает аэрозоль с медианно-массовым аэродинамическим диаметром частиц 1,1 мкм. При этом распыление вируссодержащей суспензии ведут в течение 2 минут на расстоянии 3 см от ноздрей животных. Два теленка служат контролем, им таким же способом вводят питательную среду Игла MEM. За всеми животными в течение 15 дней проводят клинические наблюдения с ежедневной термометрией, отбором проб крови для определения изменений гематологических показателей и носовых выделений с целью реизоляции исходного вируса.

Введение штамма ТМ вызывает у инфицированных телят характерные признаки острого респираторного заболевания с кратковременной диарей. Все телята заболевают на 2-3 сутки после заражения. Клинические признаки заболевания проявляются в виде угнетения общего состояния, повышения температуры тела до 42°С, серозного ринита, катарального конъюнктивита, слезотечения, выделения вязкой слюны из ротовой полости, чихания и кашля. Одновременно с повышением температуры тела у животных регистрируют лейкопению со снижением количества лейкоцитов до 3800-2880 кл./мм³, при этом количество лимфоцитов увеличивается, а нейтрофилов и эозинофилов снижается. У телят, имеющих носогубное зеркальце белого цвета, могут отмечаться эрозии и язвочки до 3-5 мм в диаметре, а также признаки кратковременной диареи (на 4-6 сутки п.и.), каловые массы имеют темный цвет со зловонным запахом. У телят снижается масса тела. От опытных телят в течение всего срока наблюдения (14 дней), начиная со второго дня после инфицирования, в перевиваемой линии культуры клеток КСТ реизолируют исходный вирус с максимальной инфекционной активностью 3,5 lg ТЦД_50/мл в то время как вирусологические исследования тампонных проб от контрольных животных дают отрицательный результат.

Пример 3. Подтверждение патогенности цитопатогенного штамма вируса Bovine Viral Diarrhea – Mucosal Disease, TM V-340.

При патологоанатомическом вскрытии трупов убитых с вынужденной целью телят регистрируют изменения в органах респираторного тракта. Устанавливают острый катаральный ринит, увеличение регионарных лимфоузлов, скопление пенистого экссудата в трахее, острую катаральную бронхопневмонию с преимущественным поражением левой доли легкого. Изменения в желудочно-кишечном тракте носят незначительный характер и проявляются в виде незначительной гиперемии слизистой оболочки дна сычуга и двенадцатиперстной кишки.

Таким образом, заявляемый штамм позволяет пополнить коллекцию штаммов вируса вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота, патогенных для телят, а заявляемый способ заражения – сократить сроки инкубационного периода болезни и понизить возрастной порог восприимчивых к заражению телят, а также расширить спектр клинических признаков вирусной диареи – болезни слизистых.

Формула изобретения

1. Цитопатогенный штамм вируса Bovine Viral Diarrhea – Mucosal Disease Virus НИИ ККМ № V-340 для изучения клиники вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота.

2. Способ экспериментального воспроизведения вирусной диареи – болезни слизистых крупного рогатого скота у телят, отличающийся тем, что суспензию штамма вируса по п.1 вводят в дозе 4×10^6,5ТЦД_50/0,1мл серонегативным к вирусу телятам 3-4-месячного возраста при помощи аэрозольного генератора БГ-2.