Патент на изобретение №2315095

(54) ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS ORYZAE – ПРОДУЦЕНТ КИСЛОЙ -АМИЛАЗЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Aspergillus oryzae 4150 получен селекцией из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (ВКПМ F-683) путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза. Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры и на косяках с сусло-агаром, в отделе биотехнологии ферментных препаратов в пищевой промышленности государственного научного учреждения ВНИИ пищевой биотехнологии г. Москвы. Изобретение обеспечивает получение кислой -амилазы с высокой активностью, превышающей аналог в 2-3 раза при сокращении длительности процесса культивирования. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к созданию нового штамма Aspergillus oryzae 4150 – продуцента кислой -амилазы с высокой общей и удельной активностью в культуральной жидкости. Штамм получен селекцией из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (ВКПМ F-683) путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза. Изобретение обеспечивает высокий уровень синтеза кислой -амилазы при сокращении длительности культивирования.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию нового штамма, используемого для получения фермента – кислой -амилазы. Амилолитические ферменты широко применяются в различных отраслях промышленности: спиртовой, крахмалопаточной, пивоваренной, винодельческой, хлебопекарной и других. Это обусловлено тем, что перерабатываемое зерновое сырье характеризуется высоким содержанием крахмала.

Амилолитические ферменты получают как продукт биосинтетической деятельности грибов или бактерий (1, 2). Ферментные препараты, полученные на основе микробиологического синтеза, имеют разные области применения. Так, бактериальные продуценты, например, Bacillus subtilis 82 (2) синтезируют -амилазы, имеющие оптимум действия в области значений рН 6,0-7,5. Их, как правило, используют в производствах, где технологический процесс проходит в нейтральной зоне рН.

Грибные продуценты синтезируют кислые -амилазы, проявляющие высокий уровень активности при значениях рН 4,5-5,5 и обладающие не только разжижающим действием, как бактериальные -амилазы, но и осахаривающим. Поэтому кислые -амилазы широко используют в хлебопекарном и бродильных производствах.

В связи с этим селекция новых грибных штаммов для получения кислой -амилазы актуальна.

Известен штамм – активный продуцент кислой -амилазы из рода аспергиллов – Aspergillus oryzae 740-A-2 (3), при твердофазном культивировании которого синтезируется кислая -амилаза. К недостатку этого продуцента относится то, что он синтезирует -амилазу с высоким уровнем активности при поверхностной ферментации.

Известен штамм Aspergillus oryzae 3-9-151 (4), обладающий способностью к синтезу -амилазы при глубинном культивировании с уровнем активности в культуральной жидкости 3-4 ед. АС/см³. Однако этот штамм характеризуется низкой продуктивностью при глубинном культивировании.

Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм Aspergillus oryzae 387 – один из наиболее активных продуцентов кислой -амилазы. В глубинной культуре известных штаммов Aspergillus oryzae 387 на 48 часов роста амилолитическая активность достигает 12-19 ед. АС/см³ в зависимости от условий культивирования (5).

Недостатком этого штамма является низкий уровень амилолитической активности культуральной жидкости и длительность ферментации.

Задачей, поставленной настоящим изобретением, является получение штамма гриба Aspergillus oryzae, обладающего высокой способностью к образованию кислых амилаз, проявляющих максимальную активность в кислой и слабокислой зоне рН.

Технический результат, получаемый от использования нового штамма Aspergillus oryzae 4150, заключается в получении кислой -амилазы с высокой активностью в культуральной жидкости (25-40 ед. АС/см³), превышающей аналог в 2-3 раза при сокращении длительности процесса культивирования.

Задача решается созданием нового штамма путем селекции и мутагенеза из известного штамма Aspergillus oryzae 387, способного к быстрому росту на простых по составу питательных средах.

Заявляемый штамм Aspergillus oryzae 4150 получен путем многоступенчатой селекции и мутагенеза с использованием химических и физических мутагенов, в частности ультрафиолета и этиленимина, депонирован в ВКПМ под №F-930.

Изучали уровни продукции амилаз в культуральной жидкости, полученной путем выращивания заявляемого штамма и известного штамма в жидкой питательной среде с аэрацией и перемешиванием. Сопутствующими ферментами при этом являлись кислые протеазы и ксиланаза. Сравнительные показатели уровней амилолитической активности культуральной жидкости штамма Asp.oryzae 4150 с прототипом представлены в табл.1. Таким образом, в результате селекции и мутагенеза получен новый штамм Aspergillus oryzae 4150, обладающий высоким уровнем синтеза -амилазы и сокращенной длительностью процесса культивирования, что позволяет повысить технологичность процесса получения ферментов кислых амилаз при использовании штамма Aspergillus oryzae 4150. Штамм отличается от известного и по культурально-морфологическим признакам.

Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры на косяках с сусло-агаром в отделе биотехнологии ферментных препаратов в пищевой промышленности государственного научного учреждения ВНИИ пищевой биотехнологии г. Москвы.

Штамм Aspergillus oryzae 4150 характеризуется следующими свойствами.

Культуральные признаки. Через 6 суток роста на сусло-агаре образуются колонии диаметром 80×80 мм, поверхность колонии пушистая, профиль колонии конусовидный, форма колонии округлая, края волнистые, цвет – белый, с возрастом цвет колонии сереет. Цвет с обратной стороны – песочный.

При росте на агаризованной среде Чапека размер колонии через 6 суток 55×55 мм, цвет ярко-белый, форма колоний округлая, края волнистые.

На всех средах наблюдается слабое спорообразование, пигменты в среду не выделяются, эксудата нет, слабый запах плесени.

Морфология штамма. Мицелий гриба тонкий, разветвленный, конидии формируются экзогенно; поверхность конидий гладкая, форма, в основном, округлая; толщина гиф 2-4 мкм.

Физиолого-биохимическая характеристика. Тип катаболизма – дыхание. Отношение к кислороду – аэроб. Оптимальная температура роста 30-32°С, максимальная – 50°С, минимальная – 18°С. Оптимальное значение рН среды для роста гриба и биосинтеза ферментов 5,4; рост продуцента имеет место в зоне рН от 2,5 до 10,0.

В качестве источника углерода гриб использует крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин, галактозу. Продуцент ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки.

Штамм непатогенный.

Штамм Aspergillus oryzae 4150 использовали для получения кислой -амилазы.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Aspergillus oryzae 4150 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука – 3,0; пшеничные отруби – 3,0; КН₂PO₄ – 1,5; остальное – водопроводная вода, рН – естественный. Ферментационную питательную среду засевают вегетативным посевным материалом в количестве 4%, выращенным при 30°С в течение 18 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 50 см³, на круговой качалке (220-240 об/мин) при температуре 30-32°С в течение 42 часов. Активность внеклеточной -амилазы составляет 33,6 ед. АС/см³.

Пример 2. Штамм Aspergillus oryzae 4150 культивируют на питательной среде следующего состава, %: крахмал – 2,0; ячменная мука – 3,0; пшеничные отруби – 3,0; КН₂РО₄ – 1,5; остальное – водопроводная вода (среда 1), рН – естественный. Засев питательной среды и культивирование штамма ведут аналогично примеру 1. Активность внеклеточной -амилазы составляет 25,0 ед. АС/см³.

Пример 3. Штамм Aspergillus oryzae 4150 культивируют на питательной среде следующего состава, %: пшеничная мука – 6,0; пшеничные отруби – 1,0; КН₂PO₄ – 1,5; остальное – водопроводная вода (среда 2), рН – естественный. Засев питательной среды и культивирование штамма ведут аналогично примеру 1. Активность внеклеточной -амилазы составляет 36,5 ед. АС/см³ _.

Пример 4. Штамм Aspergillus oryzae 4150 культивируют на питательной среде следующего состава, %: пшеничная мука – 6,0; пшеничные отруби – 2,0; КН₂PO₄ – 1,5; остальное – водопроводная вода (среда 3), рН – естественный. Засев питательной среды и культивирование штамма ведут аналогично примеру 1. Активность внеклеточной -амилазы составляет 37,2 ед. АС/см³.

Пример 5. Штамм Aspergillus oryzae 4150 культивируют на питательной среде следующего состава, %: пшеничная мука – 6,0; пшеничные отруби – 2,0; К₂HPO₄ – 1,5; остальное – водопроводная вода (среда 4), рН – естественный. Засев питательной среды и культивирование штамма ведут аналогично примеру 1. Активность внеклеточной -амилазы составляет 40,0 ед. АС/см³.

Таблица 1
Сравнительная оценка физиологической активности грибов Aspergillus oryzae – продуцентов кислой -амилазы
Штамм		Длительность культивирования, час		Амилолитическая активность, ед. АС/см3
387		48		12,0
387		120		19,0
107		42		33,6
Таблица 2
Влияние питательных сред на ферментативную активность гриба Aspergillus oryzae 4150
№ питательной среды	Ферментативная активность, ед./см3
	АС		ПС		КС
1	25,0		4,8		1,2
2	36,5		2,1		4,2
3	37,2		1,3		2,5
4	40,0		1,9		0,9

Источники информации

1. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. – М.: Пищевая пром-сть. 1975.

2. А.с. СССР №1084297, кл. С12N 1/20,1984.

3. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. – М.: ДеЛи принт.2002.

4. Двадцатова Е.А. Получение активных амилолитических ферментов из глубинных культур Аспергиллов. – М.: ЦИНТИ пищепром. 1961. Ч.1.

5. Патент РФ 2070921, кл. 12 N 1/14, 1993.

Формула изобретения

Штамм гриба Aspergillus oryzae 4150, ВКПМ F-930 – продуцент кислой -амилазы.