Патент на изобретение №2315006

(54) СПОСОБ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ВОДЫ НА ЗАГРЯЗНЕНИЕ ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к методу аналитического биотестирования воды. Для биотестирования культивируют растения ряски малой Lemna minor L. при постоянном световом и температурном режиме и составе ростовой минеральной среды. Период биотестирования составляет 7 суток. Степень токсичности оценивают через среднюю суточную долю прироста ряски малой и вычисляют по формуле: D=(B-A)/A·t, где А – исходное число листецов ряски в пробе; В – конечное число листецов; t – время роста в сутках. Количество листецов в пробах подсчитывают на 2-е, 5-е и 7-е сутки теста. Наличие загрязнителей определяют по комплексу морфологических изменений ряски. В качестве них используют специфическое изменение окраски молодых и зрелых растений с характерной локализацией на листецах, сохранение групп листецов ряски либо их распад, частичный или полный, сохранение либо отпадение корешков. Способ позволяет повысить информативность системы биотестирования воды. 1 табл.

Изобретение относится к методу аналитического биотестирования воды на загрязнение ее некоторыми тяжелыми металлами с использованием растений ряски малой, Lemna minor L., как чувствительного индикаторного организма (тест-организма).

Известен способ оценки общей токсичности почвы методом тестирования водных вытяжек почвенных образцов на растениях ряски малой и основанный на оценке количества погибших клеток листецов растений при окрашивании их сафранином (Патент №2135884 – Способ биотестирования воды и почвы на загрязнение поллютантами. Цаценко Л.В., Малюга Н.Г., 1997). Однако данный метод может применяться лишь для оценки острой токсичности образцов с относительно высоким содержанием поллютантов. В реальных же условиях зачастую необходимо обнаруживать действие низких концентраций загрязнителей, которое проявляется лишь при продолжительном их воздействии на тестируемый организм. Кроме того, указанный метод не позволяет судить о наличии в пробах конкретных загрязнителей, что представляется весьма важным при детальном анализе токсичных образцов.

Наиболее близким к предлагаемому является способ биотестирования воды на загрязнение тяжелыми металлами, включающий использование растений ряски малой, Lemna minor L., в качестве тест-организма и оценку загрязнения воды по уровню прироста листецов растения и изменению их морфологии (Патент №2096781 – Способ оценки загрязнения почв агроландшафта поллютантами. Малюга Н.Г., Цаценко Л.В., Аветянц Л.Х., 1996).

Недостатками известного способа является следующее.

1) He выдерживаются полностью стандартные условия культивирования индикаторного организма, необходимые для однозначной интерпретации получаемых результатов.

2) Принятая система оценки степени токсичности воды – коэффициент прироста растений за весь период эксперимента – не отражает в полной мере характер изменения роста ряски малой в течение всего времени проведения биотеста.

3) Из всего комплекса специфических реакций индикаторного организма фиксируется главным образом изменение окраски листецов – в ряде случаев этого оказывается недостаточным, чтобы судить о присутствии того или иного токсичного металла в тестируемой пробе.

Техническим решением задачи является повышение информативности системы биотестирования.

Поставленная задача достигается тем, что в способе биотестирования воды на загрязнение тяжелыми металлами, включающем использование растений ряски малой, Lemna minor L., в качестве тест-организма и оценку загрязнения воды по уровню прироста листецов растения и изменению их морфологии, согласно изобретению ряски малую культивируют при постоянном световом и температурном режиме, биотесты проводят при тех же условиях в течение 7 суток и оценивают степень токсичности образцов через среднюю суточную долю прироста ряски малой, вычисляемую по формуле:

D=(В-A)/A·t,

где А – исходное число листецов ряски в пробе; В – конечное число листецов; t – время роста в сутках. Присутствие загрязнителей – ионов меди, никеля и цинка определяют по комплексу морфологических изменений растений ряски малой, в качестве которых используют специфическое изменение окраски молодых и зрелых растений с характерной локализацией на листецах; сохранение групп листецов ряски малой либо их распад, частичный или полный; сохранение либо отпадение корешков у растений ряски малой.

Определение токсичности исследуемых образцов и наличия в них меди, никеля или цинка проводится следующим образом.

1. Растения ряски малой культивируют при температуре 25±2°С и интенсивности света люминесцентных ламп 3000 люкс, период освещения растений составляет 10 ч в сутки. Для культивирования используют минеральную среду, содержащую следующие компоненты, растворенные в дистиллированной воде (мг/л):

калий азотнокислый (KNO₃) – 175;

калий фосфорнокислый однозамещенный (КН₂PO₄) – 30;

калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный (K₂HPO₄×3H₂O) – 60;

кальций азотнокислый четырехводный (Ca(NO₃)₂×4H₂O) – 147;

магний сернокислый семиводный (MgSO₄×7Н₂О) – 50;

кислота борная (Н₃ВО₃) – 1.2;

меласса – 4.

Один раз в 4-5 дней растения пересаживают в емкость со свежеприготовленной средой, выбирая сходные по размеру молодые растения с ярко-зеленой окраской листецов. Для биотестирования используют культуру после 2-3 дней роста на свежей среде.

2. Анализируемые водные образцы разливают в чистые стеклянные химические стаканы объемом по 100 мл, в каждый из них помещают растения ряски малой в количестве 29-31 листецов. Контролем служит ростовая среда. Стаканы покрывают прозрачной целлулоидной пленкой для предотвращения испарения воды и оставляют на весь период тестирования в условиях постоянного температурного и светового режима.

3. На 2-е, 5-е и 7-е сутки тестирования подсчитывают число листецов для сравнительной оценки прироста и отмечают следующие морфологические признаки индикаторных растений в опытных и контрольных пробах:

сохранение либо изменение окраски листецов: пожелтение или бледность (хлороз), полное обесцвечивание (некроз), а также локализацию участков с измененной окраской и характер изменения окраски у листецов разного возраста, молодых или зрелых;

сохранение групп растений ряски малой, состоящих из 4-8 листецов, связанных гиалиновыми нитями, либо распад групп, частичный или полный, до обособленных листецов;

сохранение либо отпадение корешков у растений ряски малой.

₄, NiCl₂, ZnSO₄, CdSO₄; для удобства расчетов концентрации солей металлов в растворах выражали через микромоль/л (мкМ), соотнося эти значения с концентрациями в мг/л, принятых для размерности ПДК загрязнителей. Во всех случаях было отмечено снижение уровня прироста ряски малой в образцах, содержащих исследуемые тяжелые металлы в концентрации на уровне ПДК или ниже, особенно при долговременном культивировании (таблица 1).

Оценка доли прироста растений ряски малой в интервалах времени (0-2 суток, 2-5 суток и 5-7 суток) в течение всего периода биотестирования представляется более информативной, чем оценка прироста от начала до завершения теста (0-7 суток), так как отражает развитие токсического эффекта, неодинаковое для разных загрязнителей.

Реакция растений на медь при концентрации ионов Cu²⁺ 6.00 мкМ (0.38 г/л) наблюдалась при этом способе биотестирования уже на вторые сутки и проявлялась как побледнение или почти полное обесцвечивание (некротизация) взрослых листецов по всей поверхности, тогда как у молодых листецов области точек роста (проксимальные участки) сохраняли ярко-зеленую окраску, а обесцвечивались только их дистальные участки. Через 5 суток группы растений рассоединялись, взрослые листецы обесцвечивались и приобретали голубоватый оттенок, а у молодых оставались ярко-зелеными точки роста. Корешки отпадали у всех листецов. На 7-е сутки все растения практически погибали, одиночные взрослые листецы были полностью обесцвечены, у молодых сохранялись ярко-зелеными точки роста.

На вторые сутки наблюдалась также реакция ряски малой на цинк при концентрации ионов Zn²⁺ 7.00 мкМ (0.455 г/л): молодые листецы начинали желтеть в области точек роста (в проксимальных участках). Через 5 суток взрослые листецы частично оставались зелеными, частично же были обесцвечены в проксимальных участках на 1/2 или 3/4 своей поверхности. Молодые листецы были обесцвечены полностью или на большей части своей поверхности. Группы растений не рассоединялись, корешки у растений не отпадали. Такую же картину наблюдали и на 7-е сутки теста.

В пробах, содержащих никель в концентрации ионов Ni²⁺ 0.6 мкМ (0.035 мг/л), реакция ряски малой на вторые сутки теста не отмечалась. Через 5 суток взрослые листецы оставались зелеными, тогда как молодые становились бледно-зелеными, иногда с обесцвечиванием (некротизацией) области точек роста (проксимальных участков). Через 7 суток у мелких молодых листецов было хорошо выражено обесцвечивание проксимальных участков, некоторые листецы обесцвечивались полностью. Наблюдалось частичное рассоединение групп растений, корешки не отпадали.

В пробах, содержащих ионы кадмия в концентрации 0.01 мкМ Cd²⁺ (0.001 мг/л), листецы ряски сохраняли ярко-зеленую окраску в течение всего времени теста. Отмечалось только снижение уровня прироста растений.

Таким образом, в предлагаемом варианте биотестирования воды можно судить о степени токсичности тестируемых водных проб по приросту растений ряски в качестве основного критерия, тогда как характерный комплекс изменений морфологии листецов позволяет предполагать наличие в исследуемых пробах конкретных загрязнителей – ионов меди, никеля или цинка. Реакция индикаторных растений, проявляемая на уровне ниже ПДК меди и цинка, свидетельствует о высокой чувствительности предлагаемого способа биотестирования в отношении этих загрязнителей.

Формула изобретения

Способ биотестирования воды на загрязнение тяжелыми металлами, включающий использование растений ряски малой, Lemna minor L., в качестве тест-организма и оценку загрязнения воды по уровню прироста листецов растения и изменению их морфологии, отличающийся тем, что ряску малую культивируют при постоянном световом и температурном режиме, проводят биотесты при тех же условиях в течение 7 сут. и оценивают степень токсичности образцов через среднюю суточную долю прироста ряски малой, определяемую в интервалах 0-2 сут, 2-5 сут, 5-7 сут, и вычисляемую по формуле D=(B-A)/A·t, где А – исходное число листецов ряски в пробе; В – конечное число листецов; t – время роста в сутках, а наличие загрязнителей – ионов меди, никеля и цинка – определяют по комплексу морфологических изменений растений ряски малой, в качестве которых используют специфическое изменение окраски молодых и зрелых растений с характерной локализацией на листецах, сохранение групп листецов ряски малой либо их распад, частичный или полный, сохранение либо отпадение корешков у растений ряски малой.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 05.04.2008

Извещение опубликовано: 27.12.2009 БИ: 36/2009