Патент на изобретение №2314540

(54) МАСТЕР ПАНЕЛИ СЫВОРОТОК, СОДЕРЖАЩИХ И НЕ СОДЕРЖАЩИХ HBsAg, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии, иммунологии и вакцинологии и касается мастер-панели для определения гепатита В. Предлагается Мастер-панель лиофильно высушенных сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg, при этом положительная часть Мастер-панели включает образцы плазмы, полученные от больных гепатитом В, и состоит из 3 блоков: блок 1 включает сыворотки А & D генотипов различных субтипов HBsAg (ayw2, ayw3, adw4 и adw2), блок 2 включает положительно аттестованные сыворотки, разведенные до средних и низких концентраций (в диапазоне от 1,5 до 0,05 МЕ/мл), блок 3 включает сыворотки со значениями ОП, близкими или ниже ОПкр, положительные в ПЦР или имеющие высокие уровни аминотрансфераз; отрицательная часть панели включает образцы плазмы, полученные от доноров, лиц из групп риска и привитых. Мастер панель сывороток должна храниться при температуре 2-6°С. Разведенные сыворотки панели хранятся при температуре 2-6°С один месяц, при температуре минус 24°С – 6 месяцев. Допускается 3-кратное замораживание и оттаивание сывороток. Мастер-панель позволяет стандартизовать сыворотки, применяемые для проведение анализа на гепатит В. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, иммунологии и вакцинологии и может быть использовано в технологии изготовления панелей сывороток, содержащих антигены наиболее социально опасных вирусных инфекций.

Образцы крови доноров в России обязательно скринируют на присутствие HBsAg и анти-HIV 1+2, анти-HCV и анти – Тр антител. Приблизительно 1% всех образцов посылается на повторное подтверждение в контрольные лаборатории. Однако эффективность подтверждения результатов зависит не только от качества тест-систем, но и от наличия в контрольных лабораториях стандартных препаратов на анализируемые инфекционные маркеры [1, 2].

При использовании высокочувствительных HBsAg скриннинговых тестов носители гепатита В с низкой концентрацией HBsAg могут быть выявлены, в частности, среди лиц, которые являются носителями анти-НВс антител.

Использование в каждодневной работе препаратов различных субтипов HBsAg позволит расширить спектр диагностируемых маркеров и использовать эти материалы для контроля качества выполнения анализов препаратов крови на выявление заражения гепатитом В.

Внешний контроль качества лабораторных исследований является неотъемлемой частью обеспечения информативности и достоверности лабораторной диагностики. Серологическая диагностика HBsAg – основной инструмент контроля и профилактики гепатита В.

Для этой цели наиболее широко используется при скрининге иммуноферментный анализ (ИФА). Для выполнения ИФА используют тест-системы, представляющие собой многокомпонентные наборы ингредиентов. На эффективность проведения ИФА влияет не только качество этих ингредиентов, но и профессиональная подготовленность лабораторного персонала, обеспечивающего проведение теста [4]. Для обеспечения объективной внешней оценки качества лабораторного исследования крайне необходимы специально приготовленные и аттестованные контрольные материалы.

Известны способ изготовления контрольных панелей сывороток и панель, содержащая 5 сывороток с концентрацией HBsAg от 1 до 0,1 МЕ/мл [5]. Эта панель используется для контроля качества диагностики гепатита В.

Известны способ получения референс-панелей и панель, содержащая 10 образцов сывороток с концентрацией HBsAg от 6 до 0,25 нг/мл, в том числе 5 образцов, приготовленных на основе плазменного очищенного антигена, и 5 образцов, приготовленных на основе рекомбинантного антигена, принадлежащих к различным субтипам HBsAg, и 6 нативных донорских сывороток [6], используемых для контроля качества тест-систем и вакцин против гепатита В.

Наиболее близким к заявляемому является способ изготовления контрольной панели сывороток и панель, содержащая 10 образцов с концентрацией HBsAg от 2 нг/мл до 0.1 МЕ/мл, в том числе 5 образцов AY субтипа, приготовленных на основе плазменного очищенного антигена, и 5 образцов AD субтипа, приготовленных на основе плазменного (или рекомбинантного) антигена, содержащих не менее 98% искомого белка и 6 отрицательных образцов [7, прототип], используемая для контроля чувствительности и специфичности диагностики гепатита В.

Основным недостатком контрольной панели является отсутствие нативных образцов плазмы, которые должны адекватно представлять весь набор генотипов HBV и субтипов HBsAg, распространенных на всей территории России.

Задачей данного изобретения является:

Смоделировать национальную панель сывороток для практических ситуаций анализа образцов плазмы (сывороток) с наличием и отсутствием вируса гепатита В, с наличием и отсутствием HBsAg и с установленным диагнозом гепатит В и создание панели сывороток для оценки качества иммуноферментных тест-систем по основным показателям: чувствительности – процент выявляемости позитивных сывороток; специфичности – процент выявляемости отрицательных сывороток; и сроку годности – длительность времени панели, хранившейся при температуре 2-6°С; (отчет ВКК по уровню чувствительности, установленной в приказе МЗ), и разработать методику применения национальной панели сывороток для выполнения аттестационных испытаний качества тест-систем (и качества вакцин).

Поставленная задача решается созданием Мастер панели лиофильно высушенных сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg, полученных от людей, больных гепатитом В, добровольцев и доноров крови. Положительная часть Мастер панели включает образцы плазмы лиц, инфицированных вирусом гепатита В (образцы от № 1 до № 200), отрицательная часть панели включает образцы плазмы доноров, лиц из групп риска и привитых не инфицированных HBV (образцы №№ 201-380).

Положительная часть МП состоит из 3 блоков.

Каждый блок положительной части МП имеет свои особенности:

Образцы блока 1 аттестованы по генотипу HBV и субтипу HBsAg. Блок 1 (образцы №№ 1- 76) включает сыворотки А & D генотипов различных субтипов HBsAg (ayw2, ayw3, ayw4 и adw2), распространенных на территории России.

2-й Блок сформирован из образцов плазмы, имеющих положительный или отрицательный результат в ПЦР, но обязательно положительный результат в подтверждающем тесте на выявление HBsAg. В состав блока 2 включены образцы, разведенные до концентрации от 1,5 до 0,05 МЕ/мл.

3-й Блок составлен из образцов плазмы, в которых HBsAg выявляется одними тест-системами (и режимами постановки) и не выявляется другими тест-системами (или при других режимах постановки ИФА). Дискриминантными условиями для включения образцов в блок 3 являются: положительный результат в ПЦР при анализе DNA HBV или высокий уровень аминотрансфераз.

В состав блока включен набор сомнительных образцов, которые содержат ДНК ВГВ, или имеют высокие уровни аминотрансфераз. Однако результаты ИФА на HBsAg противоречивы в разных тест-системах. Основной причиной такого разногласия может быть недостаточная чувствительность диагностикума или наличие мутаций, которые могут значительно исказить результаты ИФА, особенно для моноклональных диагностических антител, используемых в тестируемом наборе.

Каждый образец МП аттестован по иммунобиологическим и биохимическим свойствам. Концентрация HBsAg (МЕ/мл) аттестована с помощью иммуноферментных тест-систем отечественного и зарубежного производства по показателям оптической плотности (ОП о.е.) относительно 2-го международного стандарта HBsAg, генотипа А, субтипа Adw2, код 00/580 (2^nd WHO международный стандарт “Hepatitis В Surface Antigen”, 33 МЕ/ампула, subtype adw2, genotype A, code 00/588 (NIBSC, UK);

МП предназначена для выполнения государственного контроля качества каждой серии лицензированных HBsAg тест-систем и для сертификации вновь создаваемых диагностикумов.

Мастер панель может быть использована при определении концентрации HBsAg различных субтипов в вакцинных препаратах.

Мастер панель сывороток должна храниться при температуре 2-6°С.

Разведенные сыворотки панели хранятся при температуре 2-6°С один месяц, при температуре минус 24°С – 6 месяцев. Допускается 3-кратное замораживание и оттаивание сывороток.

Мастер панели сывороток, содержащих и не содержащих поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) получают следующим образом.

1. Поступление образцов плазмы.

Образцы плазмы поступают на производство в гемаконах CPDA-1 емкостью 250 мл, герметично укупоренные.

Каждая плазма, поступающая на производство для изготовления МП, должна иметь паспорт с характеристиками – ИН (индивидуальный номер) донора, объём сыворотки, дату забора крови, предприятие-изготовитель, а также отвечать следующим требованиям: без признаков гемолиза и гиперлипидиемии, прозрачная, цвет – янтарный или светло-желтый, посторонние механические примеси, взвесь, осадок отсутствуют. Каждому гемакону присваивают кодирующий номер.

Инактивация сывороток здоровых доноров.

Гемаконы с плазмой помещают в термостат при температуре 56°С. Фиксируют время начала инактивации. Инкубирование плазмы проводят 3 ч. По истечении этого времени гемакон достают из термостата, фиксируют время окончания инактивации.

Измерение объема плазмы.

Измеряют объем каждой плазмы с помощью стерильного стеклянного мерного цилиндра.

Фасовка образцов плазмы

Из каждого гемакона в стерильном боксе в ламинаре автоматической пипеткой отбирают 10 аликвот по (1±0,05) мл плазмы в пластиковые пробирки “Эппендорф” емкостью 1,5 мл для контроля по биохимическим показателям и для исследования вирусных маркеров в ПЦР и в ИФА. Пробирки закрывают, на каждой пробирке перманентным маркером пишут кодовый номер образца плазмы.

Оставшийся объем плазмы фасуют в стерильные пластиковые контейнеры емкостью 25 мл. На каждом контейнере перманентным маркером пишут кодовый номер.

Хранение образцов плазмы

Гемаконы с донорской плазмой и их аликвоты помещают на хранение в морозильные камеры при температуре от минус 20 до минус 35°С. Гемаконы до переработки хранят при этих условиях в течение до 3-х лет. Допускается однократное замораживание и оттаивание сывороток.

Контроль аликвот плазмы методами ПЦР и ИФА.

По 2 аликвоты каждой плазмы передают в ИФА лабораторию для исследования образцов на содержание DNA HBV, HBs антигена, антител к ВГС, ВИЧ-1,2 типов и анти-HBs. ИФА анализ проводят на импортных или отечественных аттестованных ГИСК им. Л.А. Тарасовича иммуноферментных тест-системах.

Контроль биохимических показателей

По одной аликвоте каждого образца плазмы в эппендорфе, передают в биохимическую лабораторию для контроля биохимических показателей (уровень ферментов, общее содержание белка, рН). Содержание белка определяют микрометодом Лоури.

Образцы плазм, не соответствующие требованиям по биохимическим показателям, отбраковываются и утилизируются.

Добавление к сыворотке раствора консерванта.

В каждый гемакон с плазмой добавляют 2% раствор мертиолята и гентамицина из расчёта по 0,5 мл раствора каждого бактериостатика на 100 мл сыворотки и раствор хлористого кальция для осаждения балластных белков. Сыворотку (рекальсифицированную плазму) тщательно перемешивают. Конечная концентрация мертиолята в сыворотке составляет 0,01% и гентамицина 0,01%.

Приготовление пула донорских сывороток.

Из нативных сывороток крови, не содержащих маркеры вирусных инфекций, готовят пул не менее чем от 10 доноров.

Стабилизированный пул сывороток используют в качестве матрикса (РР) для приготовления образцов МП. Доводят рН раствора до 6.8-7.2 при комнатной температуре с помощью 0.1 N NaOH или 0.1 N НС1. Растворы разливают стерильно в емкости по 250-500 мл и хранят при 2-8°С в течение не более 1 месяца. В замороженном виде при температуре минус 35°С растворы можно хранить в течение 3-х лет.

1. Стабилизированный пул сывороток нормализуют по общему белку и вязкости относительно донорской сыворотки человека и получают РР. Контроль вязкости РР проводят с использованием стеклянного вискозиметра по классической методике с использованием калиброванного капилляра. Юстируют вязкость препаратов к вязкости НЧС с помощью 10% -ного раствора БСА или ФСБ.

2. Титрование препаратов HBsAg

Титрование препаратов HBsAg проводят с использованием РР на одном планшете с референс препаратами для определения концентрации HBsAg в единицах активности – МЕ/мл.

Референс-препараты HBsAg. Для выполнения аттестационных определений в работе используют стандартные препараты, аттестованные в абсолютных или в относительных единицах:

– Отраслевой стандартный образец “OCO-HbsAg” (ФС 42-28-311-00; НПО “Диагностические системы”, г. Н. Новгород, РФ).

– 2-й Международный стандарт ВОЗ, код 00/588, генотип A, Adw2 субтипа HBsAg, 33 МЕ/мл (NIBSC, UK).

3. Приготовление положительных образцов МП

Для формирования 1, 2 и 3 блоков положительной части МП изучают результаты исследований реактивных образцов в ПЦР в количественном и в подтверждающем ИФА и по уровню содержания аминотрансфераз.

Образцы сывороток с определенным генотипом и субтипом и положительные в ИФА формируют блок 1; образцы сывороток положительные в подтверждающем тесте формируют блок 2; сыворотки положительные в ПЦР или с высоким уровнем аминотрансфераз, но неопределенные в ИФА, формируют 3-й блок.

С помощью РР сыворотки блока 2 разводят в диапазоне 1,5 – 0,05 МЕ/мл.

Всего таким образом подготавливают 200 образцов для положительной части МП.

4. Приготовление отрицательных образцов МП

Для изготовления отрицательных образцов панели используют нативные сыворотки здоровых доноров, привитых и лиц из групп риска, стабилизированных и фильтрованных через 0,45 мкм. В состав МП включены 180 отрицательных сывороток (№№ 201-380).

Очистка образцов МП фильтрацией.

Тонкую очистку образцов проводят в ламинарном боксе путем фильтрации с помощью одноразовых шприцов емкостью 10 мл и одноразовых шприцевых насадок Minisart с размером пор мембраны 0,8 и 0,45 мкм. Сыворотки каждого номера после фильтрации помещают в стерильный стеклянный флакон емкостью 150 см³ и укупоривают пробкой.

Розлив образцов МП во флаконы для лиофильного высушивания.

Из биксов в кассеты укладывают 350 флаконов вместимостью 2-3 см³. Кассеты помещают в ламинар-бокс, в котором производят розлив дозатором (Diluter model 203, Beckman, USA) сывороток во флаконы. Загрузочную ёмкость с сывороткой №1 помещают в ледяную баню и перемешивают сыворотку в процессе розлива. На шкале дозатора устанавливают объём дозы 0,8 мл. Далее сыворотку разливают во флаконы, помещенные в кассеты с надписью “сыворотка №1”. После опорожнения загрузочной ёмкости дозатор и загрузочную ёмкость промывают от остатков сыворотки №1 и 2 и начинают розлив во флаконы, помещённые в кассеты с надписью “сыворотка № 12”. Таким образом разливают все 380 сывороток панели, предназначенные для одновременного лиофильного высушивания на установке. Флаконы с разлитой сывороткой прикрывают плотно резиновыми пробками для того, чтобы ограничить доступ воздуха во флаконы.

В кассету с флаконами помещают бирку, в которой указывают: наименование препарата, объём раствора во флаконе, номер сыворотки, общее количество флаконов, дату, фамилию и роспись аппаратчика, производившего розлив. Кассеты с флаконами передают на стадию лиофилизации.

Лиофильное высушивание образцов МП.

Лиофильное высушивание образцов проводят в технологическом отделе (НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ “Вектор”) на установке TG-50 (Германия). Включают компрессор установки для охлаждения конденсатора и полок сушильной камеры. Устанавливают на задатчике температуры полок температуру -35°С. По истечении 2,0-2,5 ч, при достижении температуры конденсатора минус 75-80°С, а температуры полок минус 35°С, в установку загружают кассеты с флаконами с растворами сывороток. Время загрузки кассет с флаконами в сушильную камеру должно быть минимальным и не должно превышать 10-15 мин.

На каждую полку помещают по флакону с сывороткой с погруженным в нее датчиком измерения температуры. Дверь камеры установки закрывают и закручивают запорные винты. Замораживание проводят в течение 8 часов. Температура в процессе замораживания поддерживается автоматически и контролируется аппаратчиком через каждый час с внесением данных температуры в журнал. По истечении времени процесса замораживания проводят стадию лиофильной сушки.

Управление температурным режимом сублимации производят вручную, задавая необходимую температуру полок с помощью регулятора температуры.

Заданная температура на всем протяжении сушки поддерживается автоматически с погрешностью 3-5°С. Значения температуры полки и температуры материала, а также температуры конденсатора записываются постоянно самописцем и периодически регистрируется аппаратчиком в журнале сушки 1 раз в час. Вакуум в камере контролирует по вакуумметру.

Через 8 ч после начала заморозки включают вакуум-насос установки. Температура материала в момент включения вакуум-насоса не должна превышать минус 30°С. Через четыре часа после того, как давление остаточного воздуха в камере достигнет значения 20 Па, включают нагрев полок и устанавливают на задатчике температуры полок температуру 0°С.

Через восемь часов после этого устанавливают задатчиком температуру полок плюс 10°С. Через два часа после достижения на полках температуры 10°С устанавливают задатчиком температуры полок температуру 25°С. Материал выдерживают при этой температуре 6-8 ч.

Контроль окончания процесса сушки осуществляют по показаниям датчика остаточного давления. При достижении в камере остаточного давления менее 20 Па процесс сушки считается законченным. Общая продолжительность сушки 32 ч.

Укупорка флаконов под вакуумом.

Укупорка флаконов производится внутри камеры лиофильной установки с помощью прижимных плит. По окончании процесса сушки прижимные плиты опускают с помощью гидравлического устройства вручную. Процесс укупорки контролируют визуально через смотровое окно двери камеры сушки. После звукового сигнала процесс опускания прижимных плит прекращают и поднимают прижимные плиты в исходное положение. Уравнивают давление в камере с атмосферным и открывают дверь сушильной камеры установки. Флаконы с сыворотками передают на операцию обжима флаконов колпачками.

Аттестация образцов МП, содержащих и не содержащих HBsAg

По завершении получения лиофилизированных сывороток (380 образцов), предназначенных для формирования МП, изготовитель передает 2 набора панелей в ГИСК им Л.А. Тарасовича для государственных испытаний. Вместе с наборами изготовитель передает собственные результаты испытаний специфических и физико-химических свойств сывороток панели, а также данные изучения стабильности сывороток при различных температурных режимах.

Далее следуют примеры конкретного применения мастер панели.

Пример 1. Получение мастер панели.

1. Заготовка образцов плазмы инфицированных лиц с диагнозом гепатит В и здоровых доноров выполнялась в 7-и удаленных регионах России. Образцы кодируются по городам:

Краснодар – 1

Нижний Новгород -2

Горно- Алтайск – 3

С. Петербург-4

Новосибирск – 5

Хабаровск – 6

Иркутск-7.

Заготовка плазмы проводят методом плазмафереза с письменного согласия пациента. Собранную плазму анализируют в клинической лаборатории и в замороженном виде транспортируют в ГНЦ ВБ “Вектор”.

2. На ГНЦ ВБ “Вектор” образцы плазмы кодируют, аттестуют по 10 показателям (табл. 1), разливают во флаконы по 25 мл и переносят в специализированное хранилище. Плазму хранят до использования при -35 °С.

3. По литературным прописям [8] плазму переводят в сыворотку, инактивируют и аттестовывают в PCR и ИФА для приготовления HBsAg мастер панели.

4. По результатам 3-й аттестации образцы реактивных сывороток используют для формирования положительной и отрицательной частей МП. В блок 1 включают сыворотки, которые генотипируют и субтипируют и уверенно идентифицируют в ИФА по наличию HBsAg. Всего набирают 76 образцов.

В блок 2 включают сыворотки, положительные или отрицательные в ПЦР, но положительные в подтверждающем тесте для выявления HBsAg. Для включения в панель сыворотки этого блока калибруют относительно международного стандарта и разводят в диапазоне от 1,5 до 0,05 МЕ/мл. В качестве разводящего раствора используют пул отрицательных сывороток, стабилизированных введением ЭДТА, гентамицина и мертиолята в качестве бактериостатика. Набирают 65 образцов.

B блок 3 включают сыворотки, положительные в ПЦР или имеющие высокие уровни аминотрансфераз. Образцы этого блока имеют ОП>ОПкрит в тест-системе “Рекоматгеп В” или в “Гепастрип В”, но обычно отрицательны в тесте “Monolisa Ag HBs Plus”. Набирают 59 образцов недетерминированных сывороток.

Пример 2. Применение МП для контроля качества иммуноферментных тест-систем для выявления HBsAg.

Для сертификации тест-системы для выявления HBsAg используют определенный набор образцов МП.

В каждый флакон с лиофильно высушенной сывороткой МП вносят по 800 мкл дистиллированной воды. Содержимое флакона тщательно перемешивают до полного растворения сыворотки. Сыворотки выдерживают при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее ИФА ставят в соответствии с Инструкцией по применению на аттестуемую тест-систему.

При испытаниях иммуноферментных тест-систем по показателю способности выявлять различные субтипы HBsAg следует использовать блок 1 (образцы №№ 1 -76) сывороток Мастер панели. Блок 1 включает сыворотки D & А генотипов, субтипов ayw2, ayw3, ayw4 и adw2.

При испытаниях иммуноферментных тест-систем по показателю чувствительности следует использовать блок 2 (образцы №№ 77-141) сывороток Мастер панели. Блок 2 включает образцы сывороток с концентрацией HBsAg от 1,5 до 0,05 МЕ/мл.

При испытаниях иммуноферментных тест-систем по показателю специфичности следует использовать блок отрицательных сывороток (№№ 201 -380). Блок включает сыворотки доноров, привитых и лиц из групп риска.

Учет результатов по образцам сывороток панели следует проводить только в том случае, если величины ОП контроля коньюгата, положительного (К+) и отрицательного (К-) контролей набора укладываются в пределы, регламентированные фармакопейной статьей на испытуемую тест-систему.

Социально-экономическая эффективность

1. Выявление инфекции гепатита В на более ранней стадии ускоряет излечение пациента и сокращает нетрудоспособный период пациента.

2. Использование МП значительно повышает уровень оценки качества лицензирующих тест-систем МП.

3. Национальная МП позволяет унифицировать процедуру лицензирования различных тест-систем, поступающих на российский рынок, и является юридической основой для государственного контроля.

Источники информации

3. Контроль качества клинических диагностических лабораторных исследований. Принципы и методы. Москва. – 1994, 154 стр.

4. Carrett A.J., Seagroatt V., Supran E.M. at all. – “Бюллетень ВОЗ”, 1988, т. 66, №1, стр. 44-60.

5. Патент РФ № 2179726 “Способ изготовления контрольных панелей сывороток для контроля качества гепатита В”, опубл. БИ № 5, 2002.

6. Патент РФ № 2181893 “Способ получения референс-панели сывороток, содержащих HbsAg, для контроля качества тест-систем и иммуноблотов”, опубл. БИ 12, 2002.

7. Заявка на изобретение №2003132639 “Способ изготовления контрольной панели сывороток ay & ad типов для контроля качества диагностики гепатита В”.

Формула изобретения

1. Мастер панели сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg для иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что положительная часть Мастер панели включает образцы плазмы больных гепатитом В и состоит из 3 блоков: блок 1 включает сыворотки А & D генотипов различных субтипов HBsAg (ayw2, ayw3, adw4 и adw2), блок 2 включает положительно аттестованные сыворотки, разведенные до средних и низких концентраций (в диапазоне от 1,5 до 0,05 МЕ/мл), блок 3 включает сыворотки со значениями ОП, близкими или ниже ОПкр, положительные в ПЦР или имеющие высокие уровни аминотрансфераз; отрицательная часть панели включает образцы плазмы доноров, лиц из групп риска и привитых.

2. Мастер панели сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg по п.1, отличающийся тем, что включает сыворотки, полученные от людей больных гепатитом В, привитых и доноров крови.

3. Мастер панели сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg по п.1, отличающийся тем, что панель включает лиофильно высушенные сыворотки.

4. Способ получения Мастер панели сывороток по п.1, включающий следующие стадии: получение положительной части, состоящей из блока 1, включающего сыворотки А & D генотипов различных субтипов HBsAg (ayw2, ayw3, adw4 и adw2), положительные в ИФА, блока 2, включающего положительно аттестованные сыворотки, разведенные до средних и низких концентраций (в диапазоне от 1,5 до 0,05 МЕ/мл), и блока 3, включающего сыворотки со значениями ОП, близкими или ниже ОПкр, положительные в ПЦР или имеющие высокие уровни аминотрансфераз; и получение отрицательной части, содержащей стабилизированный пул сывороток, полученный из нативных сывороток крови не менее чем от 10 доноров, не содержащих маркеры вирусных инфекций, привитых и лиц из групп риска, стабилизированный при рН 6,8-7,2 и профильтрованный через фильтр с размером ячеек 0,45 мкм; полученные положительную и отрицательную части мастер панели фасуют в стерильные флаконы, лиофилизируют и стандартизуют.