Патент на изобретение №2159285
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ПЛАЗМИДА PCDT, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ
(57) Реферат: Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для селективного уничтожения клеток, зараженных вирусом гепатита С (HCV) или его инфекционной РНК. Сущность изобретения заключается в введении в клетки плазмиды pcDT, кодирующей псевдо HCV <<->> РНК и способной направлять синтез А-субъединицы дифтерийного токсина в зараженных HCV клетках. Псевдо HCV <<->> РНК не убивает здоровые клетки, не зараженные HCV. Псевдо HCV <<->> РНК не способна к трансляции. Изобретение может быть использовано для создания вакцины против гепатита С. 3 с.п. ф-лы, 1 ил. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для селективного уничтожения клеток, зараженных вирусом гепатита С (HCV) или его инфекционной РНК. Известно, что геномная РНК вируса гепатита С размножается при помощи комплементарной HCV-специфической <<->> РНК (A.A. Khromykh, М.Т. Kenney, E. G. Westaway. Trans-Complementation of Flavivirus RNA Polymerase Gene NS5 by Using Kunjin Virus Replicon-Expressing BHK Cells. J. Virology, 1998, v. 72, N 9, p. p. 7270-7279). Оба типа реакции репликации ведет HCV-специфическая РНК-полимераза, которая узнает консервативные 5′- и 3′- последовательности в геномной и комплементарной РНК (Kolykhalov А.А., Feinstone S.M., Rice С.М. Identification of a hingly conserved sequence element at the 3 terminus of hepatitis С virus genome RNA. J. Virol. 1996, v. 70, p.p. 3363-3371). Все усилия по созданию ДНК-вакцин направлены на решение двух задач: экспрессирующих либо HCV-специфические антигены, либо образование анти-HCV рибозимов. Однако, изменчивость геномной РНК в процессе ее репликации ограничивает возможности этих двух решений. Задачей настоящего изобретения является создание плазмиды, с помощью которой можно селективно уничтожить клетки, зараженные геномной РНК вируса гепатита С (HCV). Поставленная задача решается путем создания плазмиды, названной нами pcDT, которая отличается от исходной плазмиды pSV3-nео встроенной в ее полилинкер последовательностью. При транскрипции встроенной последовательности не транслируемая РНК (псевдо HCV <<->> РНК). Однако, в случае зараженной HCV клетки, псевдо HCV <<->> РНК, из-за 5′- и 3′-концевых HCV-специфических последовательностей, способна служить матрицей для синтеза комплементарной РНК (псевдо HCV <<+>> РНК). Псевдо HCV <<+>> РНК транслируется также эффективно, как геномная РНК <<+>> HCV, но в результате ее трансляции, образуется фермент АДФ-рибозил трансфераза. Активности единственной молекулы этого фермента достаточно, чтобы убить зараженную вирусом гепатита С клетку. Способ конструирования плазмиды pcDT заключается в том, что в исходную плазмиду pSV3-neo между сайтами рестрикции HindIII и EcoRI была встроена последовательность ДНК, составленная из трех фрагментов: HindIII – Ncol и Xmal – EcoRI, а также Ncol – Xmal. Фрагменты представляли собой соответственно 5′- и 3′- концевые HCV- специфические последовательности и структурный ген А-субъединицы дифтерийного токсина. Полная нуклеотидная последовательность HindIII – EcoRI фрагмента показана на чертеже. Для получения псевдо HCV <<->> РНК in vitro последовательность ДНК, встроенную в pSV3-neo, амплифицировали в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью “безошибочной” термополимеразы Pwo II и праймеров, позволяющих в последствии транскрибировать продукт ПЦР (ампликон) РНК – полимеразой бактериофага Т7. Полученную in vitro псевдо HCV <<->> РНК смешивали с инфекционной РНК <<->> HCV и вводили методом электропорации в клетки линий Нер-2 или переживающие гепатоциты человека. Эффективность анти- HCV действия ДНК конструкции определяли после ее введения в состав ретровирусного вектора и последующей трансформации полученным вектором клеток линии Нер-2. После селекции клонов стабильно наследующих ретровирусный вектор pSV3-neo с ДНК- конструкцией, в клетки методом электропорации вводили инфекционную РНК HCV. Во всех случаях в течение 7 дней контролировали образование РНК HCV специфического антигена и амплификацию РНК в клетках и в среде. Ни в клетках, ни в среде инкубации не обнаружили инфекционных РНК HCV. Таким образом, предлагаемое изобретение имеет следующие преимущества: во-первых, обеспечивается селективное уничтожение клеток, зараженных геномной РНК вируса гепатита С (HCV); во-вторых, псевдо HCV <<->> РНК находится в составе ретровирусного вектора, что обеспечивает интеграцию конструкции в геном клеток и ее эксперссию; в-третьих, псевдо HCV <<->> РНК не способна к трансляции. Сущность изобретения поясняется на следующем примере. Пример, использования плазмиды p-cDT, кодирующей псевдо HCV <<->> РНК. 1. В ПЦР с термополимеразой Pwo II, двумя олигонуклеотидными праймерами (5′-TAATACGACTCACTATAGGGAATTCGACAGCTGGGCGG-A – 3′ и 5′-TTCACGCAGAAAGCGTCTA – 3′) и матрицей ДНК плазмиды p-cDT. 2. Выделенный ампликон использовали для его транскрипции РНК-полимеразой бактериофага Т7. 3. Полученную РНК методом электропорации вводили в клетки линии Нер-2. 4. Через 24 ч после электропорации в клетках начинали определять дифтерийный токсин. Токсин определяли в течение 120 часов после электропорации. 5. Полученную РНК смешивали с инфекционной РНК HCV и методом электропорации вводили в клетки линии Нер-2. 6. Через 6 ч после электропорации в клетках начинали определять HCV-специфические антигены и РНК, а также дифтерийный токсин. 7. Контроли показали, что за 10 ч до первых морфологических признаков гибели клеток от действия дифтерийного токсина, методом твердофазного ИФА определяется сам токсин. 8. Четкие морфологические признаки гибели клеток наблюдали через 18 ч после электропорации. Предлагаемая генно-инженерная конструкция позволяет селективно уничтожить клетки, зараженные вирусом гепатита С. Формула изобретения
РИСУНКИ
PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение
Номер и год публикации бюллетеня: 5-2002
(73) Патентообладатель:
(73) Патентообладатель:
(73) Патентообладатель:
(73) Патентообладатель:
Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 08.10.2001 № 13255
Извещение опубликовано: 20.02.2002
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 07.03.2004
Извещение опубликовано: 27.12.2004 БИ: 36/2004
|
||||||||||||||||||||||||||
