Патент на изобретение №2312358

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКРЫТОЙ АКТИВНОСТИ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО ПРОЦЕССА У ЛИЦ С ОСТАТОЧНЫМИ ПОСТТУБЕРКУЛЕЗНЫМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ В ЛЕГКИХ

(57) Реферат:

Настоящее изобретение относится к диагностическим методам. Предложенный способ определения скрытой активности туберкулезного процесса заключается в том, что у больных с бессимптомно протекающим и ограниченным активным туберкулезом легких имеется более выраженная продукция ИФН- в ответ на стимуляцию специфическим антигеном H37Rv по сравнению с лицами, имеющими неактивные, зажившие изменения в легких. Так, при разности между индуцированной и спонтанной продукцией ИФН- в супернатантах 48 часовых культур разведенной в 10 раз венозной крови от 60 до 1400 пг/мл диагностируют активный туберкулез, а при величине от 0 до 50 пг/мл отсутствие активности туберкулезного процесса. Использование способа позволяет повысить специфичность и точность диагностических тестов на определение скрытой активности туберкулезного процесса. 2 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”to culture filtrate fractions of Mycobacterium tuberculosis by microspheres, Journal of Immunological Methods Volume 235, Issues 1-2, 21 February 2000, Pages 1-9, найдено в PubMed 24.04.2007, PMID: 10675752.

Изобретение относится к медицине, а именно к области фтизиатрии и лабораторным методам исследования крови, и может быть использовано в противотуберкулезных учреждениях.

Известны способы определения скрытой активности туберкулеза у лиц с остаточными изменениями в легких путем постановки специфических туберкулинпровакационных иммунологических тестов: пробы Коха, реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ), реакции торможения миграции (РТМ), реакции оценки пролиферативной активности лимфоцитов по включению Н3 тимидина [3; 1; 4].

Однако известные способы являются недостаточно специфичными, так как в них в качестве антигена используется туберкулин, который может дать перекрестную ответную реакцию у лиц инфицированных, но не больных активным туберкулезом, это в ряде случаев не позволяет отличить активный туберкулезный процесс от давнозаживших остаточных посттуберкулезных изменений в легких, следовательно, являются неточными.

Кроме того, для повышения информативности известные способы определения активности туберкулезного процесса требуют предварительного введения туберкулина в живой организм, что не всегда безопасно, т.к. в отдельных случаях может вызвать обострение туберкулеза.

Существующие методы достаточно трудоемки и длительны во времени, так в реакции РБТЛ требуется сложный морфологический подсчет пролиферирующих клеток, а в реакции оценки пролиферативной активности лимфоцитов по включению Н3 тимидина – условия работы с радиоактивностью.

Нами впервые предложен способ определения скрытой активности туберкулезного процесса у лиц с остаточными посттуберкулезными изменениями в легких, основанный на определении индуцированной антигеном H37Rv продукции интерферона- (ИФН-) в супернатантах 48-часовой культуры гепаринизированной венозной крови и заключающийся в том, что при разности между стимулированной и спонтанной продукцией ИФН- от 60 до 1400 пг/мл диагностируют активный туберкулез, а при значениях 0 до 50 пг/мл – отсутствие активности процесса.

Метод отличается от аналогов большей специфичностью, а следовательно, является более точным, так как в нем в качестве стимулятора используется антиген, полученный из вирулентного штамма микобактерий туберкулеза, отсутствием необходимости подкожного введения туберкулина в живой организм, исследования проводятся только in vitro, облегчением конечного этапа оценки результатов с помощью иммуноферментного анализатора.

Способ осуществляется следующим образом.

Для постановки реакции используется стерильно взятая гепаринизированная венозная кровь (1-3 мл), предварительно разведенная в 10 раз средой RPMI, содержащей 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 0,1 мМоль L-глютамина и по 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина. Исследования проводятся в 96-луночных культуральных планшетах, на каждого пациента используется 2 лунки. В первую лунку вносится разведенная гепаринизированная венозная кровь в количестве 200 мкл без стимулятора, во вторую – эта же кровь в равном объеме с добавлением 10 мкл антигена H37Rv в рабочей концентрации 10 мкг/мл. Технология получения антигена разработана в Российском НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ, используется суспензия гамма-облученной (2,5 мегарад) биомассы вирулентного штамма H37Rv, обработанная с помощью ультразвукового диспергатора мощностью 100 Вт при 22 кГц в течение 40 циклов по 1 минуте. Используют супернатант после центрифугирования (18 тысяч об/мин – 30 мин), обработанный ультразвуком биомассы (соникат) [2].

Планшеты, содержащие разведенную венозную кровь, инкубируют при температуре 37°С в атмосфере 100% влажности и 5% СО₂ в СО_2-инкубаторе в течение 48 часов. По истечении времени инкубации надосадочную жидкость собирают и используют для определения ИФН- с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с применением 2-х моноклональных антител к ИФН- в авидин-биотиновой системе (тест-система “гамма-Интерферон-ИФА-Бест”, Новосибирск), согласно прилагаемой инструкции [5]. Учет реакции проводится путем измерения оптической плотности исследуемых образцов на иммуноферментном анализаторе при длине волны 450 нм и построения калибровочной кривой по результатам титрования стандартного раствора ИФН-. У каждого пациента определяют 2 показателя: спонтанную продукцию в лунках без добавления стимулятора и индуцированную антигеном H37Rv в лунках с добавлением стимулятора. Рассчитывают показатель , представляющий собой разность между индуцированной и спонтанной продукцией ИФН-. При значениях от 60 до 1400 пг/мл диагностируют активный туберкулез, а при значениях от 0 до 50 пг/мл – отсутствие активности туберкулезного процесса, интервал значений от 50 до 60 пг/мл требует повторного проведения исследования или применения других методов. Всего обследовано 12 больных активным туберкулезом легких и 13 лиц с остаточными посттуберкулезными изменениями в легких. Активность процесса у лиц с бессимптомным течением туберкулеза подтверждена обнаружением микобактерий туберкулеза или динамикой рентгенологической картины. Результаты исследований представлены в таблице 1 и 2.

Таблица 1
Уровень спонтанной и индуцированной антигеном H37Rv продукции ИФН- у больных активным туберкулезом легких.
Пациенты		Уровень ИФН- в супернатантах крови (пг/мл)
		Спонтанно		В ответ на H37Rv	H37Rv
1.С.		40		1400	1360
2.Ч.		40		500	460
3.А.		50		130	80
4.Ф.		55		55	0
5.С.		30		110	80
6.Г.		80		80	0
7.Т.		20		45	25
8.Е.		40		750	710
9.С.		40		100	60
10.М.		40		140	100
11.Х.		110		180	70
12.П.		300		450	150
Таблица 2
Уровень продукции ИФН- у лиц с остаточными посттуберкулезными изменениями в легких
Пациенты	Уровень ИФН- в супернатантах крови (пг/мл)
	Спонтанно		В ответ на антиген H37Rv			H37Rv
1.Ш.	20		20			0
2.И.	50		50			0
3.Ч.	20		40			20
4.С.	20		50			30
5.Х.	40		80			40
6.Я.	40		40			0
7.С.	0		20			20
8.Л.	70		80			10
9.К.	20		40			20
10.П.	30		30			0
11.А.	40		90			50
12.М.	50		50			0
13.П.	30		30			0
( H37Rv – разность между индуцированной и спонтанной продукцией ИФН-).

Получена достоверно более интенсивная продукция ИФН- в ответ на стимуляцию антигеном H37Rv у лиц с бессимптомным и ограниченным, но активным туберкулезом легких по сравнению с лицами, имеющими зажившие посттуберкулезные изменения в легких.

Пример 1.

Больная Ч.А. – 50 лет, находилась на стационарном лечении в Саратовском областном противотуберкулезном диспансере с диагнозом: Очаговый туберкулез 1-2 сегмента левого легкого в фазе инфильтрации МБТ-. Выявлена по обращению с жалобами на сухой кашель, слабость, потерю в весе. Имела массивный семейный контакт с больными туберкулезом сыном и дочерью. При объективном исследовании изменений по органам не установлено. Рентгенологически в 1-2 сегментах левого легкого выявлена группа очаговых теней мелких и средних размеров с нечеткими контурами, слабой интенсивности. Проводилось иммунологическое обследование. Спонтанная продукция ИФН- в супернатанте 48-часовой культуры разведенной венозной крови составила 40 пг/мл, индуцированная антигеном H37Rv – 500 пг/мл, H37Rv – 460 пг/мл.

Пример 2.

Пациентка С., 42-х лет. В настоящее время жалоб не предъявляет. При очередном флюорографическом исследовании в верхней доле левого легкого (1-2 сегмент) выявлена группа мелких очаговых теней средней интенсивности, в окружающей легочной ткани линейные тени, обусловленные ограниченным фиброзом. В прошлом, в 1983 году болела инфильтративным туберкулезом верхней доли левого легкого. Получала антибактериальное лечение с положительным клинико-рентгенологическим эффектом. Предшествующая рентгенологическая документация не сохранилась. С целью уточнения активности выявленных изменений проводилось иммунологическое обследование. Спонтанная продукция ИФН- в супернатанте 48 часовой культуры венозной крови равна 0 пг/мл, индуцированная антигеном H37Rv 20 пг/мл, H37Rv 20 пг/мл. Окончательный диагноз: Плотные очаги. Фиброз.

Остаточные изменения в легочной ткани считаются неактивными, данная пациентка не нуждается в проведении антибактериальной терапии.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить скрытую активность туберкулезного процесса и отличить активные изменения в легких, требующие длительной антибактериальной терапии от неактивных посттуберкулезных изменений в легких. Полезность предложенного метода заключается в возможности быстро, в течение 3-х дней, определить активность туберкулеза легких и своевременно решить вопрос о необходимости лечения. Это позволит предотвратить прогрессирование патологического процесса у активных больных и в то же время избавит лиц с неактивными изменениями в легких от необоснованной 3-месячной химиотерапии, что будет иметь медицинский и экономический эффект.

Источники информации

2. Владимирский М.А. Иммунологические и биотехнологические методы в повышении эффективности диагностики и лечения туберкулеза: Автореф. дис. … д-ра мед. наук – М., 1993. – 48 с.

3. Гавриленко B.C. Критерии клинического излечения туберкулеза легких. – М.: Медицина, 1977. – 150 с.

4. Применение новых иммунологических методов при туберкулезе. М.М.Авербах, В.И.Литвинов, В.Я.Гергерт и др.: Методические рекомендации ЦНИИТ АМН России. – М., 1992. – 42 с.

5. Инструкция по применению набора реагентов А-8752 “Гамма-Интерферон-ИФА-Бест” ЗАО “Вектор-Бест”, Новосибирск. Лицензия №42/055/2001.

Формула изобретения

Способ определения скрытой активности туберкулезного процесса у лиц с остаточными посттуберкулезными изменениями в легких, основанный на индукции иммунокомпетентных клеток специфическим стимулятором, отличающийся тем, что у пациентов, имеющих остаточные изменения в легких и при отсутствии клинически значимых признаков активного туберкулеза, in vitro определяют продукцию ИФН- в супернатантах 48-часовых культур разведенной в 10 раз гепаринизированной венозной крови до и после внесения in vitro антигена H37Rv, и при значении разности индуцированной антигеном и спонтанной продукции ИФН- от 60 до 1400 пг/мл диагностируют активный туберкулез, а при значениях от 0 до 50 пг/мл отсутствие активности туберкулезного процесса.