Патент на изобретение №2159251

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕЦЕПТОРОВ ЛАКТОГЕННЫХ ГОРМОНОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биологии, к способам выделения рецепторов гормонов. Из молока животных выделяют и промывают жировые глобулы. Обрабатывают их детергентом тритоном Х-100. Полученный солюбилизат мембран жировых глобул молока очищают. С помощью аффинной хроматографии выделяют рецепторы. В качестве активированного сорбента используют пролактин, иммобилизованный на эпоксиактивированном TSK-геле. Сорбент получают в результате инкубации при рН буфера 7,4-9,0. Изобретение позволяет получить рецепторы лактогенных гормонов в чистом виде и повысить эффективность их производства. 4 ил. ^

Изобретение относится к области биологии, к исследованию материалов путем разделения на компоненты с использованием хроматографии, в частности к способам выделения рецепторов гормонов с помощью обычной жидкостной и аффинной хроматографии высокого давления из компонентов молочных продуктов.

Известны способы выделения рецепторов лактогенных гормонов из органов животных, основанные на экстракции белковых фракций, в частности, из амниотической жидкости и из гипофиза животных. Однако эти способы требуют большого количества исходного материала, трудоемкой препаративной очистки, сложного процесса экстрагирования.

Наиболее близким к заявленному решению является способ определения концентрации рецепторов лактогенных гормонов (авторское свидетельство N 1751665 от 30.07.92 г. авторов Лариной М.М. и Федосимова В.А.).

Суть способа – прототипа заключается в следующем: мембраны жировых шариков, содержащие рецепторы лактогенных гормонов, выделяют из молока коров и подвергают рецепторному анализу путем инкубации этих мембран с меченым I¹²⁵ пролактином и нативным пролактином в инкубационном буфере.

Затем мембраны отделяют от буфера путем центрифугирования и определяют количество связанного с рецепторами меченого пролактина по радиоактивности проб.

Константу диссоциации и концентрацию рецепторов лактогенных гормонов определяют по графику Скэтчарда методом регрессионного анализа (с помощью программы “Дельта”, разработанной в МГУ для двухцентровой модели связывания).

Недостатком прототипа является то, что выделенные рецепторы лактогенных гормонов связаны с мембранами жировых глобул молока, что не обеспечивает чистоту полученных рецепторов гормонов. Это обстоятельство, в свою очередь, позволяет проводить с рецепторами только количественный анализ и не позволяет исследовать их физико-химические и биологические свойства.

Кроме того, известный способ включает применение рецепторного анализа – трудоемкого, дорогостоящего и связанного с радиоактивными препаратами.

Целью заявленного решения является повышение эффективности способа.

Указанная цель достигается тем, что в известном способе для иммобилизации пролактина используют активированный сорбент – эпоксиактивированный TSK-гель, а инкубацию проводят в течение 2-х часов при температуре 25^oC и pH буфера от 7.4 до 9.0.

Заявленный способ позволяет получать рецепторы лактогенных гормонов в чистом виде и использовать их в научных и медико-биологических исследованиях физиологии и биохимии лактогенной функции организма.

Сущность заявленного способа заключается в следующем: из молока различных видов животных выделяют жировые глобулы и тщательно их промывают. Мембраны жировых глобул солюбилизируют с помощью детергента Тритона X-100. Из полученного солюбилизата с помощью аффинной хроматографии выделяют лактогенные рецепторы в чистом виде. Раствор рецепторов концентрируется, затем проводится исследование физико-химических и биологических свойств рецепторов для данного вида и данной особи с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЖХВД) (фиг. 1).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Выделение и обработка жировых глобул молока.

Свежее молоко фильтруют через ватные фильтры. Из фильтрованного молока выделяют жировые глобулы путем центрифугирования в течение 40 мин при 10^oC при 3000 об/мин. Выделенные жировые глобулы промывают теплой водой, дозируют по порциям и помещают на хранение в холодильник при -40^oC.

2. Солюбилизация мембран жировых глобул молока (МЖГМ).

Солюбилизацию МЖГМ выполняют с помощью детергента Тритона X-100: в замороженные жировые глобулы добавляют необходимое количество 1%-ного Тритона X-100 в 0.04 М фосфатном буфере с pH 7.4.

Эмульсионную смесь жировых глобул инкубируют в растворе детергента при постоянном помешивании в течение 3 часов при 30^oC.

После инкубации солюбилизат, содержащий остатки мембран и выделившийся жир, центрифугируют 1 час при 0^oC при 3000 об/мин. Затем плотный слой жира удаляют из центрифужных стаканов, а солюбилизат фильтруют через обычные фильтры для удаления оставшихся кусочков жира, далее – через микрофильтры – для очистки от крупных мицелл казеина и остатков мембран жировых глобул.

3. Освобождение солюбилизата от Тритона X-100.

Известно, что детергент Тритон X-100 вызывает комплексообразование основного лактогенного гормона – пролактина.

Для очистки солюбилизата от Тритона X-100 авторы предлагают использовать очень простую ячейку, заполненную сорбентом TSK HW-40 (фиг. 2). Ячейка предварительно промывается буфером (0.04 М фосфатный буфер с pH 7.4, содержащим 0.1% альбумина). Буфер удаляется полностью из ячеек центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об/мин.

После удаления буфера в ячейки вносят порции солюбилизата и снова центрифугируют при тех же условиях. Каждая ячейка способна полностью очистить от 1%-ного Тритона X-100 30 мл солюбилизата. Одновременно применение 4 ячеек в центрифуге K-70 позволяет очистить от детергента 120 мл солюбилизата.

Исследование адсорбции Тритона X-100 показало, что при соотношении солюбилизата, содержащего 1% Тритона X-100, и геля TSK HW-40 1:3 по объему прохождения Тритона X-100 через ячейки ничтожно мало и составляет 1.4% и менее от исходного количества.

Очищенный солюбилизат из МЖГМ помещают на хранение в морозильник при -20^oC.

4. Очистка рецепторов лактогенных гормонов.

Очистку рецепторов лактогенных гормонов, выделенных из МЖГМ, от различных компонентов мембран белковой и небелковой природы проводят с помощью аффинной хроматографии. Для ее осуществления авторы предлагают использовать реакционноспособный сорбент, содержащий в качестве активных групп эпоксидные циклы и полученный путем привитой сополимеризации TSK HW-65 геля с глицидилметакрилатом.

Привитая сополимеризация геля осуществляется в окислительно-восстановительной среде в присутствии солей церийаммонийнитрата – Ce(NH₄)₂(NO₃)₆, которые инициируют привитую сополимеризацию.

5. Иммобилизация пролактина на активированном сорбенте – эпоксиактивированном TSK-геле.

Известно, что во время присоединения лигандов к активированному сорбенту эпоксидные группы реагируют с аминогруппами лигандов, образуя ковалентные связи. Степень присоединения определяется первичными аминогруппами лиганда и зависит от pH, состава буфера, температуры и времени инкубации.

Кроме того, присоединение определенного белка зависит в какой-то степени и от свойств этого белка.

В процессе исследований авторами установлены оптимальные значения этих параметров: pH, состава буфера, температуры и времени инкубации для адсорбции пролактина с активированным сорбентом.

В заявленном способе авторы предлагают использовать говяжий пролактин (производство фирмы “Гормон”, Москва) с активностью 20 МЕ. В качестве инкубационного буфера предлагается 0.5 М Na₂CO₃. Инкубацию сорбента с пролактином проводят при перемешивании при 25^oC. Оптимальные условия связывания пролактина обеспечиваются в буфере с pH 9.0 при 25^oC в течение 2-х часов инкубации. Данные опытов приведены на фиг. 3.

При этих условиях связывается с гелем 51% содержащегося в инкубационном буфере пролактина.

При увеличении времени инкубации до 4 часов при 25^oC количество связанного пролактина увеличивается до 58%.

Поскольку некоторое количество активированных групп в сорбенте остаются свободными и после присоединения лигандов, эти группы обычно блокируют избытком первичного амина – этоколамина, глицина, глюкозамина и др. Авторы предлагают использовать для этой цели 10%-ный раствор трис-OH в 0.5 М Na₂CO₃, pH 9.00. Инкубацию трис-OH буфера с сорбентом проводят при 25^oC в течение 3 часов при постоянном помешивании. Затем сорбент промывают.

Промытый сорбент с иммобилизированным пролактином используют для опытов или помещают на хранение в холодильник при 4^oC в 0.5 М растворе NaCl.

Для связывания рецепторов ЛГ с иммобилизированным на эпоксиактивированном TSK-геле пролактином сорбент инкубируют с солюбилизатом из МЖГМ в течение 18 часов при 25^oC в 0.04 М фосфатном буфере с pH 7.4. Затем сорбент переносят в стеклянные фильтры Шотта и тщательно промывают водой, буфером и окончательно еще раз водой.

Десорбцию рецепторов с комплексом ПРЛ-рецептор выполняют с помощью 0.05 М раствора ацетата аммония (NH₄CH₃COO), pH 4.2, содержащего 0.1% Тритона X-100.

Сорбент с иммобилизированным на его поверхности комплексом ПРЛ-рецептор инкубируют в растворе ацетата аммония в течение 1 часа при 25^oC. Затем смесь сорбента с раствором переносят в специальные ячейки (фиг. 2) с TSK HW-40 гелем и центрифугируют. При этой операции раствор с десорбированными с комплекса рецепторами ЛГ освобождается от Тритона X-100.

Очищенные с помощью аффинной хроматографии рецепторы ЛГ имеют в растворе очень низкую концентрацию, которая находится за пределами чувствительности УФ-детектора. Авторы предлагают концентрировать растворы, в содержащие рецепторы ЛГ, с помощью эмирсионных фильтров CX-10 (Millipore). Один фильтр CX-10 способен отфильтровать 20 мл жидкости за 6-7 часов. Авторами выполнено концентрирование раствора рецепторов в 20 раз.

На фиг. 4 представлена хроматограмма очищенных и сконцентрированных рецепторов ЛГ из МЖГМ. На хроматограмме четко видны три пика. Первый пик проходит в свободном объеме гельфильтрующей колонки (TSK SW 4000) и имеет молекулярный вес не менее 2000 КД. Очевидно, этот пик представляет собой рецепторные кластеры, солюбилизированные с МЖГМ.

Второй пик на хроматограмме имеет кажущейся молекулярный вес 56 КД и представляет собой мономерную форму рецептора ЛГ.

Третий пик на хроматограмме представляет собой продукты распада рецепторов ЛГ с молекулярным весом менее 10 КД.

Таким образом, осуществляется контроль качества полученных рецепторов.

Список использованной литературы
1. Описание изобретения к А.С. N 1751665 авторов: Лариной М.М. и Федосимова В.А. на “Способ определения концентрации лактогенных рецепторов”.

2. Biol Chem. Hoppe – Seyler, vol. 374, pp. 271-279, 1993. Johrke, B. Kruger, T.Viengutz, The Celycolylation as Source of the Variability in prolactin Patterns of Jnolividl al Human Amniotic Fluids.

Формула изобретения

Способ получения рецепторов лактогенных гормонов, включающий выделение жировых глобул молока центрифугированием, отличающийся тем, что жировые глобулы молока обрабатывают детергентом Тритоном Х-100, полученный солюбилизат мембран жировых глобул молока очищают, рецепторы выделяют с помощью аффинной хроматографии на активированном сорбенте, в качестве которого используют пролактин, иммобилизованный на эпоксиактивированном TSK-геле, полученный в результате инкубации при рН буфера от 7,4 до 9,0.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 30.04.2001

Номер и год публикации бюллетеня: 35-2002

Извещение опубликовано: 20.12.2002