Патент на изобретение №2311925

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО АЛЛЕРГЕНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к фармакологии и медицине, конкретно к способу получения диагностического аллергена из тараканов. Способ включает щелочную экстракцию исходного сырья с последующим центрифугированием, фильтрованием и стерилизующей фильтрацией целевого продукта, при этом в качестве исходного сырья используют смесь замороженных тараканов, которые измельчают, после измельчения добавляют эфир, встряхивают, фильтруют, высушивают до полного испарения эфира, растирают до порошкообразного состояния и к полученному порошку повторно добавляют эфир, сушат до полного испарения эфира, затем проводят щелочную экстракцию, перемешивают экстрагируемый материал и ежедневно в течение 3 суток встряхивают трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа, в интервалах между встряхиванием хранят при температуре от 2 до 10°С, после экстракции надосадочную жидкость сливают, центрифугируют, а после стерилизующей фильтрации стерильный раствор аллергена выдерживают от 1 до 3 месяцев при температуре от 2 до 10°С. Изобретение обеспечивает расширение номенклатуры диагностических аллергенов и создание высокоэффективного препарата для диагностических заболеваний, вызванных сенсибилизацией к тараканам.

Изобретение относится к фармакологии и медицине, конкретно к способу получения диагностического аллергена из тараканов Blatella germanica.

Известен способ получения диагностического аллергена, включающий щелочную экстракцию исходного сырья, в качестве которой используют культуру клещей домашней пыли Дерматофагоидес фарина или Дерматофагоидес птерниссинус и водно-солевую экстракцию исходного сырья (RU 2265450, А61К 39/00, 2005 г.).

Основной причиной круглогодичных респираторных аллергозов (бронхиальная астма, аллергические бронхиты, аллергические конъюктивиты и др.) являются аллергены жилища человека. В состав основного из них – домашней пыли – входят продукты жизнедеятельности различных организмов, спутников биоценоза человека: клещи, насекомые, домашние животные и др. Последнее десятилетие исследователями обращено внимание, как на причину аллергозов, на тараканов, которые встречаются в жилище человека во всех регионах мира. Показано, что 60-80% больных бронхиальной астмой сенсибилизировано к тараканам; максимальные цифры приводятся для США и Японии, несколько ниже для стран Ближнего Востока – Израиль.

На территории СНГ подобных исследований не проводилось, имеются лишь косвенные данные о высокой частоте встречаемости IgE-антител к тараканам у детей, однако они получены с помощью зарубежных тест-систем. Основная причина этого – отсутствие аллергена. С другой стороны, препараты дальнего зарубежья носят преимущественно разовый характер и нуждаются в более подробной физико-химической характеристики и стандартизации. Такая работа в настоящее время активно проводится за рубежом.

Для диагностики повышенной чувствительности к тараканам необходим аллерген, который можно использовать как для постановки кожных проб, так и для использования в реакциях ин витро. Такого аллергена в отечественной аллергологической практике нет.

Расширение номенклатуры производимых препаратов для диагностики аллергических состояний является актуальной задачей практического здравоохранения. К препаратам, которые необходимы для решения данной проблемы, относится и аллерген из тараканов, разработанный в ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.

Техническим результатом изобретения является расширение номенклатуры диагностических аллергенов и создание высокоэффективного препарата для диагностики заболеваний, вызванных сенсибилизацией к тараканам.

Для достижения указанного технического результата в способе получения диагностического аллергена, включающем щелочную экстракцию исходного сырья с последующим центрифугированием, фильтрованием и стерилизующей фильтрацией целевого продукта, согласно изобретению в качестве исходного сырья используют смесь замороженных тараканов, которые измельчают, после измельчения добавляют эфир в соотношении 1:3, встряхивают 10 минут, фильтруют, высушивают до полного испарения эфира, растирают до порошкообразного состояния и к полученному порошку повторно добавляют эфир, используя на 60 грамм сырья 300 мл эфира, сушат до полного испарения эфира, затем проводят щелочную экстракцию при рН 7,0-7,2, перемешивают экстрагируемый материал в течение 30-40 минут и ежедневно в течение 3 суток встряхивают трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа, в интервалах между встряхиванием хранят при температуре от 2 до 10°С, после экстракции надосадочную жидкость сливают, центрифугируют при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут, фильтруют, а после стерилизующей фильтрации стерильный раствор аллергена выдерживают от 1 до 3 месяцев при температуре от 2 до 10°С.

Сущность изобретения поясняется следующим примером.

Пример. Диагностический аллерген из тараканов разработан в ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.

Для получения диагностического аллергена в качестве исходного сырья используют смесь замороженных тараканов. Навеску тараканов из морозильной камеры переносят в фарфоровую ступку и мелко нарезают ножницам. Добавляют эфир в соотношении 1:3, встряхивают 10 минут, смесь фильтруют через бумажный фильтр и оставляют в вытяжном шкафу до полного испарения эфира. Измельчение частично обезжиренного сырья производят в фарфоровой ступке, растирая до порошкообразного состояния. Полученный порошок подвергают вторичному обезжириванию, которое производят в стеклянных банках с притертыми пробками, используя на 60 грамм сырья 300 мл эфира. Полностью обезжиренное сырье рассыпают на эмалированные лотки с фильтровальной бумагой и сушат в вытяжном шкафу до полного испарения эфира. Порошок аллергена помещают в фарфоровую ступку вместимостью 0,5 литра и добавляют 100 мл экстрагирующей жидкости. Экстрагирующей жидкостью может быть любой буферный раствор, имеющий рН 7,0-7,2. Порошок растирают пестиком до гомогенной суспензии и переносят в бутыль вместимостью 3 литра, в которую затем добавляют еще 1,9 литра экстрагирующей жидкости. Содержимое бутыли осторожно перемешивают и оставляют на 30-40 минут, после чего контролируют значение рН. Коррекцию рН проводят добавлением 1,0 моль/л раствора гидроокиси натрия или 0,1 моль/л раствора соляной кислоты до значения рН 7,0-7,2. В последующие три дня для более полного извлечения белково-полисахаридных комплексов проводят следующий режим обработки: ежедневно бутыль с экстрагируемым материалом помещают на аппарат для встряхивания жидкостей в сосудах трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа. В интервалах между встряхиваниями бутыль с экстрагируемым материалом должна находиться в холодильной камере при температуре от 2 до 10°С. Ежедневно проводят коррекцию рН аллергенного экстракта до 7,0-7,2. После окончания экстрагирования надосадочную жидкость сливают и осуществляют центрифугирование на рефрежираторной центрифуге при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут с последующей фильтрацией через бумажный фильтр. Далее проводят стерилизующую фильтрацию. В день проведения данной операции необходимо отконтроллировать значение рН аллергенного экстракта. Проводят контроль маточного раствора аллергена: в тот же или на следующей день с соблюдением всех правил асептики отбирают из бутыли пробы для контроля: посев на стерильность, проверку значения рН, который должен иметь величину 7,0-7,2. Визуально оценивают физические свойства: препарат должен быть прозрачным, без посторонних включений, темно-коричневого цвета. Содержание единиц белкового азота определяют по методу Несслера. Стерильный раствор аллергена для стабилизации физических биологических свойств выдерживают от 1 до 3 месяцев при температуре от 2 до 10°С. В тех случаях, когда содержание единиц белкового азота в маточном растворе аллергена превышает 10000 PNU/мл, маточный раствор аллергена разводят стерильной экстрагирующей жидкостью.

После разлива аллергена получают готовую форму препарата.

Полученный препарат изучали с учетом поставленных целей и задач. На первых этапах провели лабораторное изучение псевдоаллергических и неспецифических иммунных свойств препарата. Так как «псевдосвойства» имеют дозозависимость, экстракт тел тараканов брали в различных концентрациях: для культуры лимфоцитов таким образом, чтобы конечное содержание его составило 100, 500, 10000 мкг/мл (по белку), для непрямого теста дегрануляции тучных клеток – 100, 500, 10000 мкг/мл для аллергена, вносимого в систему «тучные клетки крысы – сыворотка больного». Ни одна из испытанных концентраций аллергена не вызывала достоверного прироста ИЛ2Р-позитивных лимфоцитов (2,3±0,65; 3,2±0,65; 3,9±0,88 для концентраций 100, 500, 1000 мкг/мл). Отдельные высокие значения прироста активированных лимфоцитов можно отнести за счет систематической ошибки метода. С другой стороны, с учетом того, что данная реакция отражают сенсибилизацию организма безотносительно к ее характеру, указанные пациенты могли быть чувствительны к тараканам, не по реагиновому типу. Для дальнейшей работы выбрали минимальную концентрацию аллергена – 100 мкг/мл. По результатам исследований сделано предположение об отсутствии у полученного препарата неспецифических иммуногенных свойств, которые присущи многим иммуногенным и аллергенным субстанциям. Оценку псевдоаллергенных свойств экстракта проводили в непрямом тесте дегрануляции тучных клеток перитонеальной жидкости крыс с сыворотками тех же доноров. Ни у одной из испытуемых сывороток доноров не зарегистрировано превышения границы нормы. Однако прослеживаются тенденции к росту псевдоаллергических свойств с повышением концентрации белка в препарате аллергена: если различия в проценте дегранулированных клеток для концентраций 100 мкг/мл и 500 мкг/мл статистически не достоверны (р<0,05), то для концентраций 100 мкг/мл и 1000 мкг/мл – достоверны (р<0,05).

Имеет место некоторая тенденция к увеличению числа активированных лимфоцитов в контрольных культурах, что может быть связано с их меньшей устойчивостью. Средние уровни прироста ИЛ2Р-позитивных лимфоцитов оказалось достоверно выше у больных, чем у здоровых (4,8±0,75% против 2,3±0,65%, р<0,001). Результаты теста активации лимфоцитов у 11 больных (44%) могут быть отнесены к высокодостоверным диагностическим классам, свидетельствующим о наличии сенсибилизации организма.

Средний процент дегрануляции тучных клеток крыс составил 30,6±3,42%, что превышает критическую величину в 30%. Иными словами даже в общей группе больных тест оказался положительным. У 12 больных (48%) показатели НДТК свидетельствуют о присутствии реагиновых антител в сыворотке.

В настоящее время проводится работа по более тонкой характеристике полученного аллергена. Поскольку аналоги подобных исследований в странах СНГ отсутствуют, необходимо привести некоторые предварительные результаты работы. Проводили гель-хроматографию на колонке (35±1,5 см), заполненной сефадексом G-75. На колонку наносили 800 мкг препарата, элюцию проводили 0,15М фосфатным буфером рН 7,4; скорость элюции 20 мл/ч. Образец элюировался двумя основными пиками, что достаточно необычно, поскольку наносили цельный экстракт тел аллергенов. Причем последний пик по объему выхода совпадает с выходом 0,25% раствора фенола, что позволяет идентифицировать его именно с ним. При нанесении на колонку чистого сывороточного альбумина оказалось, что он элюируется единым пиком, предшествуя первому пику препарата, можно думать о том, что молекулярная масса элюируемого белка ниже, чем чистого сывороточного альбумина (то есть меньше 60-70 кДа). Подобные рассуждения подтверждаются и данными диск-электрофореза: выявлена только одна полоса в грубом экстракте тел тараканов – иными словами, при используемом методе экстракции в водную фазу переходит только один белок из массы белков таракана. Идентичная по электрофоретической подвижности полоса присутствует только в одной пробе (фракция 6, которая совпадает с первым пиком). В других трубках аналогичных полос выявлено не было. Белковая фракция в препарате аллергена обладает большей подвижностью в электрическом поле, чем молекулы чистого сывороточного альбумина. Это свидетельствует, с одной стороны, о меньшей молекулярной массе имеющего белка, а с другой – о кислом его характере (движение к положительно заряженному полюсу). С концентрированными хроматографическими фракциями был поставлен тест непрямой дегрануляции тучных клеток крыс, в котором использованы сыворотки больных бронхиальной астмой, имевшим сильные скарификационные пробы и положительный результат в этой реакции с цельным экстрактом аллергена. Аллергенная активность присутствовала в концентрированной фракции 6.

Формула изобретения

Способ получения диагностического аллергена, включающий щелочную экстракцию исходного сырья с последующим центрифугированием, фильтрованием и стерилизующей фильтрацией целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют смесь замороженных тараканов, которые измельчают, после измельчения добавляют эфир в соотношении 1:3, встряхивают 10 мин, фильтруют, высушивают до полного испарения эфира, растирают до порошкообразного состояния, и к полученному порошку повторно добавляют эфир, используя на 60 г сырья 300 мл эфира, сушат до полного испарения эфира, затем проводят щелочную экстракцию при рН 7,0-7,2, перемешивают экстрагируемый материал в течение 30-40 мин и ежедневно в течение 3 суток встряхивают трижды по 30 мин с интервалом 1,5 ч, в интервалах между встряхиванием хранят при температуре от 2 до 10°С, после экстракции надосадочную жидкость сливают, центрифугируют при 5000-6000 об./мин в течение 30-40 мин, фильтруют, а после стерилизующей фильтрации стерильный раствор аллергена выдерживают от 1 до 3 месяцев при температуре от 2 до 10°С.