Патент на изобретение №2311643
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ АПОПТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В КОЖЕ У БОЛЬНЫХ ПСОРИАЗОМ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии. Для оценки состояния апоптической системы в коже у больных псориазом производят забор образцов пораженной кожи, замораживают в жидком азоте, измельчают, не допуская размораживания. Из проб выделяют РНК клеток кожи. После чего проводят обратную транскрипцию. Полученные продукты разделяют при помощи гельэлектрофореза в агарозном геле, детектируют количество полученных продуктов ПЦР размером 487 п.о. – bax и 127 п.о. – bcl-2 и определяют соотношение bax/bcl-2, по значению которого оценивают состояние апоптической системы. При нормальном значении этого показателя – 0,200±0,050 состояние апоптической системы оценивают как стабильное, а при увеличенном его более чем на 30% по сравнению с нормой – как активированное. Использование способа позволяет точно и объективно определить соотношение индуцирующих и блокирующих апоптоз белков в коже с использованием количественных критериев, по их значению оценить состояние апоптической системы и подобрать адекватную терапию.
(56) (продолжение): CLASS=”b560m”вопросу о патогенезе псориаза. Российский журнал кожных и венерических болезней. 2006, № 2, с.24-27. КОСАК М. A. et al, Examination of Bcl-2, Bcl-X and bax protein expression in psoriasis. Int. J. Dermatol. 2003 Oct; 42(10): 789-93. [он-лайн] [найдено 28.11.2006]. Найдено из базы данных PubMed, PMID: 14521691. KAWASHIMA К. A. al. Evaluation of cell death and proliferation in psoriatic epidermis. J. Dermatol Sci. 2004 Sep; 35(3): 207-14., [он-лайн] [найдено 28.11.2006]. Найдено из базы данных PubMed, PMID: 15381242.
Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, и может быть использовано для исследования патогенетических механизмов развития псориаза при разработке алгоритма диагностики и лечения данного заболевания, а также в молекулярной биологии и биохимии. Псориаз является заболеванием с недостаточно изученной этиологией и патогенезом, поэтому проведение адекватного лечения этого заболевания затруднительно. В последние 5 лет активно стал обсуждаться вопрос о нарушении процесса апоптоза в коже, в частности за счет нарушенного соотношения индуцирующих (bax) и блокирующих (bcl) апоптоз белков семейства bcl-2 как основных звеньев патогенеза псориаза. Согласно данным последних исследований bcl-2 и его гомологичные протеины являются одними из наиболее важных регуляторов программируемой гибели клеток, выполняющих ключевую роль в поддержании баланса между жизнью и гибелью клеток (Hana TOMKOVA Wataru FUJIMOTO Jiro ARATA / Expression of the bcl-2 homologue bax in normal human skin, psoriasis vulgaris and non-melanoma skin cancers / Eur J Dermatol. Vol.8, Is 4, June 1998: 256-60, Investigative report). В связи с этим актуальной является задача разработки адекватного, доступного и информативного способа оценки апоптических реакций в коже при псориазе с целью выбора патогенетически обоснованной тактики его диагностики и лечения. Известен способ определения состояния апоптической системы при псориазе и раке кожи путем оценки уровня экспрессии протеина bax в коже (Hana TOMKOVA Watam FUJIMOTO Jiro ARATA / Expression of the bcl-2 homologue bax in normal human skin, psoriasis vulgaris and non-melanoma skin cancers / Eur J Dermatol. Vol.8, Is 4, June 1998: 256-60, Investigative report), заключающийся в регистрации bax-иммунореактивности кератиноцитов в участках пораженной и нормальной кожи методом иммуногистохимического окрашивания. Сущность способа заключается в постановке иммунохимической реакции на образцах биопсии кожи и последующей флуоресцентной микроскопии препаратов. Полученные образцы заливают в парафин на 1 сутки. Серийные образцы наклеивают на предметные стекла. Перед микроскопированием с образцов удаляют парафин, производят дегидратацию ксололом. Для лучшего выявления bax образцы на слайдах кипятят в 10 ммоль нитратном буфере (рН 6) в течение 5 мин. После инактивации эндогенной пероксидазной активности 0,3% гидрогенной пероксидазой в кислом растворе буферного фосфата предметные стекла преинкубируют с 1% бычьим сывороточным альбумином а затем инкубируют с моноклональными античеловеческими bax антителами мышей (bax-alpha, clone 4F11, MBL, Nagoya, Japan), разбавляя 1:200 при 4°С. Реакцию проводят стандартным методом, используя 1:350 раствор козьего анти-мышиного IgG (Immunotech, Marseilles, France). Визуализацию реакции с диаминабензидином проводят при помощи контрастирующего окрашивания метиленовым зеленым. При этом устанавливают распределение протеина bax в коже, по повышенной экспрессии которого судят об активации процесса апоптоза. Способ используют для изучения фундаментальных вопросов патофизиологических механизмов развития заболеваний кожи. Недостатком способа является выявление повышенной экспрессии только протеина bax, что является недостаточным для точного отражения состояния системы апоптоза в коже. Кроме того, метод флуоресцентной микроскопии является недостаточно чувствительным и требует использования дорогостоящего оборудования. В качестве ближайшего аналога принят способ оценки состояния апоптической системы по определению уровня экспрессии белка bcl-x и степени фрагментации ДНК в пораженной коже при псориазе (Yasuko Fukuya, Megumu Higaki, Yuko Higaki, Makoto Kawashima. Effect of vitamin D3 on the increased expression on Bcl-xl in psoriasis. Arch Dermatol Res (2002) 293: 620-625). Способ заключается в том, что в коже определяют уровень экспрессии bcl-x иммуногистохимическим методом, экспрессию РНК протеина bcl-x методом RT-PCR и степень фрагментации ДНК терминальным деоксинуклеотидил трансфераз-медиированным dUTP nick-end маркировочным методом (TUNEL). Образцы пункционной биопсии пораженной кожи больного псориазом разделяют на три части, одну из которых заливают в парафин для проведения метода TUNEL, одну замораживают в ОСТ составе для иммуногистохимического метода, оставшуюся часть замораживают для выделения мРНК. Принцип метода TUNEL состоит в флуоресцентном энзиматичееком мечении фрагментов ДНК в местах разрывов. Определение степени фрагментации ДНК клеток полученных образцов проводят с использованием набора Boexrjnger Mannhejm (Mannhejm Germanj). Депарафинированные образцы кожи обрабатывают 20 мг/мл протеиназы К в течение 20 минут при комнатной температуре и промывают три раза в фосфат-буферном растворе. Затем инактивируют эндогенную пероксидазу с 0,3% Н2O2 в течение 30 минут при комнатной температуре, образцы кожи трижды промывают в фосфат-буферном растворе, содержащем ТТ и окрашенные флуоресцеином при 37°С во влажной среде в течение 60 минут. Затем образцы трижды промывают в фосфат-буферном растворе и проводят реакцию с антифлюоресцентными антителами, конъюгированными с пероксидазой при 37°С в течение 30 минут, затем образцы три раза промывают в фосфат-буферном растворе и окрашивают с 3-амино-9-этилкарбозолом. Метод позволяет точно оценить факт фрагментации ДНК, при этом выявление дискретных фрагментов, характерных для апоптоза, фиксируется в виде пиков флуоресцентного сигнала. Для пометки фрагментов ДНК используют фермент терминальную деоксинуклеотидил трансферазу. Интенсивность флуоресценции обратно пропорциональна величине фрагментов ДНК: при полном расщеплении на фрагменты сигнал будет наиболее ярким, так как количество фрагментов в этом случае максимальное. Высокая степень фрагментации ДИК свидетельствует о выраженной активности апоптического процесса. мРНК клеток выделяют с использованием набора Jsogen (Nippon Gene, Toyama, Japan) в соответствии с инструкцией производителя и проводят реакцию обратной транскрипции, используя набор RNA PCR (Takara, Osaka, Japan). К продукту обратной транскрипции добавляют bcl-x-специфические праймеры (forward primer, 5-CCCAGAAAGGATA-CAGGCTGG; reverce primer, 5-CTCCTGGATGGAGGCTCTA) или Метод используют для изучения роли апоптической системы в патогенезе заболеваний кожи. Однако известный способ не является точным. Определение повышенной экспрессия только протеина bcl-x, а не соотношения bax/bcl, a также отсутствие количественных критериев не отражает состояние апоптической системы в коже, не позволяет точно определить степень выраженности процесса апоптоза и выработать адекватную тактику лечения. Недостатком способа является также необходимость применения специального дорогостоящего оборудования, сложность, трудоемкость, обусловленные сочетанием трех методов исследования, необходимость специально подготовленного высококвалифицированного персонала и высокая стоимость исполнения метода. Кроме того, метод TUNEL имеет диагностическую ценность только на поздних стадиях процесса апоптоза, сопровождающихся фрагментацией молекул ДНК. В то время как на ранних стадиях апоптоза, при которых фрагментация ДНК отсутствует либо выражена незначительно, этот метод неточен. Задачей изобретения является создание эффективного, простого и точного способа оценки состояния апоптической системы в коже больных псориазом. Сущность изобретения состоит в том, что способ оценки состояния апоптической системы в коже у больных псориазом характеризуется тем, что производят забор образцов из пораженного участка кожи, которые замораживают в жидком азоте, измельчают, не допуская размораживания, из проб выделяют РНК клеток кожи, для чего добавляют к ним Trizol реагент с гуанидинтиоционатом и оставляют при температуре 4°С на 5 минут, затем вносят в пробирку 200 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта в соотношении их объемов 49:1, интенсивно перемешивают и оставляют при 4°С на 5 минут, после этого центрифугируют пробирку со смесью 5 мин при 14000 об/мин для расслоения фаз, прозрачную верхнюю фазу с РНК отделяют, смешивают с равным объемом изопропанола, оставляют при -20°С на 30 мин, повторно центрифугируют, полностью удаляют супернатант, добавляют в пробирку 1 мл холодного 75% этилового спирта, перемешивают, центрифугируют и осторожно удаляют супернатант, осадок сушат при температуре 65°С в течение 3 мин, затем добавляют в него 100 мкл 17 МОм воды, суспендируют на вортексе 15 секунд и подогревают при 65°С 5 мин, выделенную РНК хранят при -70°С, после этого проводят обратную транскрипцию, для чего в пробирки для полимеразно-цепной реакции вносят: буфер, dNTP, 100 ед. обратной транскриптазы M-MLV, 20 ед. ингибитора РНК-аз RNasin (Promega), случайные гексануклеотидные праймеры и РНК до конечной концентрации не более 100 нг/мкл, смесь термостатируют 1 час при 37°С, затем проводят полимеразно-цепную реакцию в оптимизированной буферной системе-ПЦР-амплификаторе с 30 нг кДНК, полученной в результате обратной транскрипции с конечной концентрацией 0,2 мМ каждого дезоксинуклеотида, 1,5 мМ MgCI-s 0,2 мкМ каждого из праймеров для bax и bcl-2, и 0,1 мкМ для GAPDH, 0,1 ед/мкл Taq-полимеразы, для контроля выделения РНК и обратной транскрипции в объеме 50 мкл, полученные продукты разделяют при помощи гельэлектрофореза в агарозном геле, детектируют количество полученных продуктов ПЦР размером 487 п.о. – bax и 127 п.о. – bcl-2 и определяют соотношение bax/bcl-2, по значению которого оценивают состояние апоптической системы, и при нормальном значении этого показателя – 0,200±0,050 состояние апоптической системы оценивают как стабильное, а при повышении его более чем на 30% по сравнению с нормальным значением этого показателя у здоровых людей – как активированное. Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат. Способ является высокоэффективным. Он позволяет определить объективно и точно соотношение индуцирующих и блокирующих апоптоз белков в коже с использованием количественных критериев и по значению полученных показателей определить степень выраженности патологического процесса, чувствительности кожи в очагах псориаза к действию экзогенных повреждающих факторов и подобрать индивидуализированную адекватную данному состоянию кожи терапию, направленную на снижение скорости апоптических реакций и соответственно активности патологического процесса. Весь процесс диагностики, включая забор ткани, занимает несколько часов. Способ прост в исполнении, очень чувствителен и информативен, а также не требует использования дорогостоящего оборудования. Режим замораживания и измельчения образцов кожи отработан авторами на лабораторных животных (мышах). Приведенная методика является универсальной и может быть использована с применением высокоточных и высокочувствительных приборов Real Time PCR, применение которых более простое в исполнении и позволяет получить более точные результаты по сравнению с использованием флюоресцентных микроскопов в иммуногистохимическом методе. Способ может быть эффективно использован не только в биохимической, но и в любой клинической лаборатории, позволяя решить вопрос об адекватной оценке состояния апоптической системы в образцах кожи при псориазе, что позволяет наиболее объективно выбрать способ лечения и методику его проведения в каждом конкретном случае. Технический результат достигается за счет того, что авторы впервые определяют соотношение индуцирующих и блокирующих апоптоз белков bax/bcl-2 непосредственно в поврежденной коже в очагах псориаза, что позволяет получать точные объективные показатели активности апоптической системы, выраженные в количественных критериях, по их значению оценить степень активации патологического процесса и на основании этого выбрать оптимальную тактику лечения, включающую патогенетически обоснованную антиапоптическую терапию. В указанной методике состояние апоптической системы кожи оценивают посредством определения уровня экспрессии белков апоптоза в лимфоцитах крови, что является некорректным, так как у клеток кожи патерность экспрессии отличается от лимфоцитов. Кроме того, некорректной является оценка уровня апоптоза по исследованию только одного форменного элемента крови. Следует отметить, что уровень активности энзимов апоптоза в различных тканях организма различен. Изменение уровня апоптоза крови отражает патологические процессы, происходящие не только в коже, но в любых органах и тканях организма, и поэтому некорректно судить о состоянии кожи по уровню процесса апоптоза в крови. То есть оцененный таким образом уровень активности апоптической системы в крови не соответствует состоянию системы апоптоза в коже, и поэтому данный метод не является надежным диагностическим параметром состояния системы апоптоза кожи, что делает описанный способ неточным и неэффективным. Кроме того, выделение лимфоцитов крови требует использования специального оборудования, что усложняет и способствует удорожанию данной методики. Предложенный способ отличается тем, что для определения степени активности апоптической системы кожи исследуют комплекс клеток, образующих кожную ткань и, следовательно, учитывают степень патологических изменений в ткани, а не в отдельно выделенном ее элементе. Авторами предложены количественные критерии оценки состояния апоптической системы, полученные в результате обработки статистических данных на основании сравнительной оценки показателей. Разработан точный и информативный, адекватный состоянию ткани пораженной кожи способ оценки состояния системы апоптоза в коже у больных псориазом, который основан на определении соотношения индуцирующих и блокирующих апоптоз белков по уровню их мРНК. По изменению соотношения между указанными параметрами в очаге пораженной кожи при псориазе по сравнению с неизмененной кожей здоровых людей судят об активности апоптического процесса при псориазе. Впервые показана эффективность определения соотношения bax/bcl-2 для патогенетически обоснованного диагноза псориаза и выбора лечения для того или иного пациента. Способ осуществляется следующим образом. Производят забор биоптатов кожи больного псориазом из пораженного участка кожи (Sambrook, J. and D.W. Russell. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (2001) 3rd edition). Для этого под местной анестезией с помощью дерматологического пробойника препарируют образец кожи. Образцы пораженной кожи быстро замораживают в жидком азоте вплоть до определения биохимических параметров. Время от начала процедуры забора биоптатов до замораживания не должно превышать 15 секунд. Взятые пробы взвешивают и измельчают в ступке, не допуская размораживания образца. Из полученных проб выделяют РНК клеток кожи с использованием Trizol реагента с гуанидинтиоционатом (Rainer Hipfel, Claus Garbe, Birgit Schittek. RNA isolation from human skin tissues for colorimetric differential dispay. J. Biochem. Biophys. Methods 37 (1998) 131-135). Для этого в пробирку объемом 1,5 мл вносят исследуемую пробу и добавляют 1 мл Trizol реагента и интенсивно перемешивают. Пробирку со смесью оставляют при температуре 4°С на 5 минут. Вносят в пробирку 200 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта в соотношении их объемов 49:1 и интенсивно перемешивают. Пробирку со смесью переносят на 4°С на 5 минут. Центрифугируют пробирку со смесью 5 мин при 14000 об/мин для расслоения фаз. Прозрачную верхнюю фазу с РНК осторожно отделяют и переносят в чистую пробирку объемом 1,5 мл. Смешивают с равным объемом изопропанола. Перемешивают интенсивно содержимое пробирки и оставляют при -20°С на 30 мин. Центрифугируют пробирку со смесью 15 мин при 14000 об/мин. Полностью удаляют супернатант, переворачивая пробирку. Добавляют в нее 1 мл холодного 75% этилового спирта, перемешивают содержимое, переворачивая пробирку 4-5 раз, центрифугируют 5 мин при 14000 об/мин и осторожно удаляют супернатант, переворачивая пробирку. Осадок сушат при температуре 65°С в течение 3 мин. Добавляют в пробирку 100 мкл 17 МОм воды. Суспендируют содержимое на вортексе (прибор для встряхивания и перемешивания) 15 секунд и подогревают при 65°С 5 мин. Выделенную РНК хранят при -70°С. Затем проводят обратную транскрипцию (Yasuko Fukuya, Megumu Higaki, Yuko Higaki, Makoto Kawashima. Effect of vitamin D3 on the increased expression on Bcl-xl in psoriasis. Arch Dermatol Res (2002) 293: 620-625). В пробирки для ПЦР объемом 200 мкл вносят: буфер, dNTP, 100 ед. обратной транскриптазы M-MLV (Promega), 20 ед. ингибитора РНК-аз RNasin (Promega), случайные гексануклеотидные праймеры и РНК до конечной концентрации не более 100 нг/мкл. Смесь термостатируют 1 час при 37°С. Для контроля выделения РНК и обратной транскрипции проводят ПЦР с праймерами на «ген домашнего хозяйства» GAPDH. Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) используют 30 нг кДНК, полученной в результате обратной транскрипции. ПЦР проводят в оптимизированной буферной системе – ПЦР-амплификаторе, с конечной концентрацией 0,2 мМ каждого дезоксинуклеотида, 1,5 мМ MgCI-s 0,2 мкМ каждого из праймеров для bax и bcl-2, и 0,1 мкМ для GAPDH, 0,1 ед/мкл Taq-полимеразы. Реакцию проводят в объеме 50 мкл. Праймеры:
ПЦР проводят в ПЦР-амплификаторе, используя следующую программу: (1) 95°С в течение 2 мин, (2) 94°С в течение 45 с, (3) 53°С в течение 45 с, (4) 72°С в течение 1 мин 30 сек, (5) этапы 2-5 повторяют 30 раз, (6) 72°С в течение 7 мин. Продукты ПЦР разделяют при помощи гельэлектрофореза в агарозном геле (1,5% агароза 1000). Детектируют количество полученных продуктов ПЦР размером 487 п.о. (bax) и 127 п.о. (bcl-2). Количество продуктов определяют денситометрированием и определяют соотношение bax/bcl-2, по значению которого оценивают состояние апоптической системы. При нормальном значении этого показателя – 0,200±0,050 состояние апоптической системы оценивают как стабильное, а при увеличенном его более чем на 30% по сравнению с нормальным значением этого показателя (контрольным) у здоровых людей состояние алоптической системы оценивают как активированное. Это позволяет выбрать патогенетически обоснованную терапию, включающую антиапоптические препараты. Дозы и схема назначения антиапоптических препаратов подбирают индивидуально в зависимости от соотношения bax/bcl в участках пораженной кожи при псориазе. Способ испытан на базе Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН на 17 больных псориазом, из них 10 мужчин и 7 женщин в возрасте от 16 до 53 лет и давностью заболевания от 1 до 12 лет. У всех больных был выявлена повышенное содержание протеина р53 в очагах псориаза, что позволяет предположить его ведущую роль в развитии этого дерматоза. Пример. Больной М., 41 года, страдает псориазом в течение последних 8 лет. Под местной анестезией у больного в лопаточной области производят забор биоптатов из пораженного участка кожи. Образцы пораженной кожи быстро замораживают в жидком азоте. Взятые образцы измельчают, не допуская размораживания. Затем из проб выделяют РНК клеток кожи, добавляя к ним 1 мл Trizol реагента с гуанидинтиоционатом, и оставляют при 4°С на 5 минут, затем добавляют в пробирку 200 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта в соотношении их объемов 49:1, после чего смесь переносят на 4°С на 5 минут. Пробирку со смесью центрифугируют 5 мин при 14000 об/мин, осторожно отделяют прозрачную верхнюю фазу с РНК, смешивают с равным объемом изопропанола, оставляют при -20°С на 30 мин. Повторно центрифугируют смесь 15 мин при 14000 об/мин, после чего полностью удаляют супернатант, переворачивая пробирку, затем добавляют в пробирку 1 мл холодного 75% этилового спирта, перемешивают, центрифугируют 5 мин при 14000 об/мин и осторожно удаляют супернатант, полученный осадок высушивают при температуре 65°С в течение 3 мин, затем добавляют в него 100 мкл 17 МОм воды, суспендируют на вортексе 15 секунд и подогревают при 65°С 5 мин. Обратную транскрипцию проводят, термостатируя буфер, dNTP, 100 ед. обратной транскриптазы M-MLV (Promega), 20 ед. ингибитора РНК-аз RNasin (Promega), случайные гексануклеотидные праймеры и РНК в конечной концентрации не более 100 нг/мкл в течение 1 часа при 37°С. Для контроля выделения РНК и обратной транскрипции проводят реакцию ПЦР в оптимизированной буферной системе (ПЦР-амплификаторе) с 30 нг кДНК, полученной в результате обратной транскрипции, с праймерами на «ген домашнего хозяйства» GAPDH с конечной концентрацией 0,2 мМ каждого дезоксинуклеотида, 1,5 мМ MgCI-s, 0,2 мкМ каждого из праймеров для bax и bcl-2, и 0,1 мкМ для GAPDH, 0,1 ед/мкл Taq-полимеразы в объеме 50 мкл, полученные продукты разделяют при помощи гельэлектрофореза в агарозном геле (1,5% агароза 1000), затем детектируют количество полученных продуктов ПЦР размером 487 п.о. (bax) и 127 п.о. (bcl-2). Определяют соотношение содержания апоптоз-индуцирующего белка bax и апоптоз-блокирующего белка bcl-2 по уровню их мРНК. В результате проведенных реакций и расчетов определяют, что у данного больного в участке поврежденной кожи исходное соотношение bax/bcl-2 равно 0,617, т.е. оно увеличено по сравнению с контрольными нормальными значениями этого показателя у здоровых лиц (0,200±0,050). По полученным данным оценивают состояние апоптической системы в пораженной коже как активированное, для коррекции которого рекомендовано назначение препаратов, обладающих антиапоптическим эффектом. После проведения соответствующего курса лечения по достижении клинической ремиссии псориатического процесса уровень соотношения протеинов bax/bcl-2 понизился до 0,245, что приблизилось к нормальным значениям этого показателя. Таким образом, указанный клинический пример демонстрирует диагностическую эффективность и точность способа, значимость определения соотношения bax/bcl-2 в участках поврежденной кожи больных псориазом с целью определения активности апоптической системы.
Формула изобретения
Способ оценки состояния апоптической системы в коже у больных псориазом, характеризующийся тем, что производят забор образцов из пораженного участка кожи, которые замораживают в жидком азоте, измельчают, не допуская размораживания, из проб выделяют РНК клеток кожи, для чего добавляют к ним Trizol реагент с гуанидинтиоционатом и оставляют при температуре 4°С на 5 мин, затем вносят в пробирку 200 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта в соотношении их объемов 49:1, интенсивно перемешивают и оставляют при 4°С на 5 мин, после этого центрифугируют пробирку со смесью 5 мин при 14000 об/мин для расслоения фаз, прозрачную верхнюю фазу с РНК отделяют, смешивают с равным объемом изопропанола, оставляют при -20°С на 30 мин, повторно центрифугируют, полностью удаляют супернатант, добавляют в пробирку 1 мл холодного 75% этилового спирта, перемешивают, центрифугируют и осторожно удаляют супернатант, осадок сушат при температуре 65°С в течение 3 мин, затем добавляют в него 100 мкл 17 МОм воды, суспендируют на вортексе 15 с и подогревают при 65°С 5 мин, выделенную РНК хранят при -70°С, после этого проводят обратную транскрипцию, для чего в пробирки для полимеразно-цепной реакции вносят буфер, dNTP, 100 ед. обратной транскриптазы M-MLV, 20 ед. ингибитора РНК-аз RNasin, случайные гексануклеотидные праймеры и РНК до конечной концентрации не более 100 нг/мкл, смесь термостатируют 1 ч при 37°С, затем проводят полимеразно-цепную реакцию в оптимизированной буферной системе – ПЦР-амплификаторе с 30 нг кДНК, полученной в результате обратной транскрипции с конечной концентрацией 0,2 мМ каждого дезоксинуклеотида, 1,5 мМ MgCI-s 0,2 мкМ каждого из праймеров для bax и bcl-2, и 0,1 мкМ для GAPDH, 0,1 ед/мкл Taq-полимеразы, для контроля выделения РНК и обратной транскрипции в объеме 50 мкл, полученные продукты разделяют при помощи гельэлектрофореза в агарозном геле, детектируют количество полученных продуктов ПЦР размером 487 п.о. – bax и 127 п.о. – bcl-2, определяют соотношение bax/bcl-2, по значению которого оценивают состояние апоптической системы, и при нормальном значении этого показателя – 0,200±0,050 состояние апоптической системы оценивают как стабильное, а при повышении его более чем на 30% по сравнению с нормальным значением этого показателя у здоровых людей – как активированное.
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 07.04.2008
Извещение опубликовано: 27.05.2010 БИ: 15/2010
|
||||||||||||||||||||||||||
-актин-специфические праймеры (forward primer, 5-CTACAATGAGCTGCGTGTGG; reverce primer, 5-ATAGCAACGTACATGGCTGG) и осуществляют полимеразно-цегшую реакцию с 2.5 U Taq полимеразой (Takara). В термоблоке для проведения реакций (Perkin Elmer Chiba Japan) РНК денатурируют при 95°С 90 с, затем ренатурируют при 54°С 90 с и выпрямляют при 72°С 90 с. Полученный продукт анализируют с помощью электрофореза с 1,5% агарозным гелем в ТВЕ буфере (Nippon Gene) и визуализируют при УФ освещении после окрашивания этидиумом бромидом. Праймеры для bcl-x образовывают 500-нуклеотидные фрагменты, контрольные