Патент на изобретение №2311641

(54) СПОСОБ СКРИНИНГОВОГО ОТБОРА ПОДРОСТКОВ 10-20 ЛЕТ В ГРУППУ РИСКА ПО РАЗВИТИЮ РЕСПИРАТОРНОЙ ПАТОЛОГИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к клинико-биохимическим и лабораторным методам диагностики. Для отбора подростка в группу риска по развитию респираторной патологии определяют уровень средних молекул в моче (УСМ), поверхностную (ПА) и коллагеназную (КА) активность конденсата паров выдыхаемого воздуха (КВВ). В случае, если значения УСМ не менее чем на 10% и КА КВВ не менее чем на 15% выше, а значение ПА КВВ не менее чем на 10% ниже уровней данных показателей здоровых, относят подростка в группу риска. Использование способа позволяет повысить точность выявления подростков 10-20 лет с повышенным риском развития респираторных заболеваний. 1 з.п. ф-лы.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”diseases in exhaled breath. Biomarkers. 2002, 7(1), p.1-32, PMID: 12101782, реф., [он-лайн], [найдено 30.10.2006], найдено из базы данных PubMed. RINAUDO JB et al. Some aspects of middle molecules toxicity. Artif Organs., 1981, 4 Suppi, p.90-93, PMID: 7295102, реф., [он-лайн], [найдено 30.10.2006], найдено из базы данных PubMed.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинико-биохимическим и лабораторным методам диагностики и может быть использовано в детской поликлинической службе, подростковой медицине (включая юношей призывного возраста), детской клинической пульмонологии для формирования системы мероприятий по первичной профилактике, а также ранней доклинической диагностике. По данным ВОЗ ежегодно в мире умирают от ОРЗ около 2,2 млн. человек и около 190 тысяч из них – от пневмонии. В настоящее время респираторная заболеваемость у детей в России составляет примерно 5000 на 1000 детей в год, хотя обращаемость – 1000-2000 на 1000 (Шабалов Н.П. «Детские болезни», «Питер», стр.299, 2002 г.).

Болезни органов дыхания (БОД) занимают основное место в структуре общей заболеваемости (от 49,3% у детей, 32,9% у подростков, до 17% у взрослых) и 4-е место в структуре смертности населения Российской Федерации. В течение последних 25 лет XX века заболеваемость населения болезнями органов дыхания (БОД) неуклонно возрастала и остается стабильно высокой среди взрослого населения. Среди детей и подростков наблюдается непрерывный рост показателей распространенности БОД, что в ближайшие годы может привести к увеличению числа взрослых больных хронической легочной патологией. Общая заболеваемость БОД в 2002 г. среди населения России в целом составила 35374,3 случая на 100000, что превышает аналогичный показатель для болезней системы кровообращения более чем в 2,2 раза.

Не менее серьезная ситуация складывается по уровню смертности населения по причине БОД (69,8 случая на 100000). В целом с 1990 г. смертность населения от БОД в Российской Федерации увеличилась на 11%.

В стране отсутствует целостная и последовательная система профилактики БОД как среди здорового населения, так и в группах риска.

16 сентября 2003 г. решением Коллегии Минздрава России утверждена Концепция развития пульмонологической помощи населению Российской Федерации (2004-2008 гг.), одной из целей которой является разработка и реализация стратегии профилактики БОД. Среди задач концепции, такие как

– разработка и реализация программ по предупреждению возникновения заболеваний органов дыхания;

– развитие и совершенствование методов экспресс-диагностики и лечения острой дыхательной недостаточности;

– развитие диагностической базы в амбулаторно-поликлинических учреждениях для обеспечения скрининговой диагностики заболеваний органов дыхания (А.Г.Чучалин, А.В.Аверьянов, Н.В.Антонова. А.Л.Черняев с соавт. Концепция развития пульмонологической помощи населению Российской Федерации (2004-2008 гг.) Пульмонология, №1, 2004 г., стр.34-37).

БОД у детей возникают чаще и протекают тяжелее, чем у взрослых, с более быстрым развитием дыхательной недостаточности, что связано как с анатомо-физиологическими особенностями органов дыхания, так и особенностями реактивности детского организма. Своеобразие иммунологической реактивности детского организма (в том числе относительно меньшая способность к синтезу гуморальных антител – иммуноглобулинов, особенно секреторного иммуноглобулина А), особенности воспалительной реакции обуславливают большую легкость проникновения и распространения инфекции, меньшие возможности для ее быстрого уничтожения в организме. Все это и определяет большую частоту возникновения и более тяжелое течение респираторной патологии у детей (Н.П.Шабалов, «Детские болезни», издательство «Питер», 2002, том 1, стр.299-303).

В настоящее время разработаны различные методы диагностики БОД, основанные на оценке происходящих в организме изменений в процессе развития патологического процесса, т.е. уже на стадии заболевания. Большинство из них являются инвазивными и небезопасными (рентгенологические, лабораторные – клинический анализ крови, исследование плевральной жидкости, бронхиального секрета и др.), что ограничивает их применение в педиатрии и не дает возможности предотвратить возникновение и развитие заболевания.

Существование начальных стадий БОД без выраженных клинических проявлений диктует необходимость активного выявления группы детей и подростков с ранними симптомами болезни, а также определение факторов риска возникновения данной патологии на доклиническом этапе для проведения комплекса профилактических мероприятий дифференцированно.

Известен способ прогнозирования заболеваемости острыми респираторно-вирусными инфекциями детей первого года жизни (п.РФ №2097763, опубл. 27.11.1997). Способ основан на определении в пуповинной крови новорожденного абсолютного содержания лимфоцитов и Т-лимфоцитов и при уровне лимфоцитов менее 1,5·10⁹/л, а Т-лимфоцитов – менее 0,4·10⁹/л, прогнозируют повышенную заболеваемость ребенка. Недостатками данного способа являются: инвазивный характер способа, трудоемкость выполнения, так как требуется наличие клинической и иммунологической лаборатории, применимость только к новорожденным сразу после момента рождения.

Известен способ прогнозирования респираторных заболеваний у спортсменов (п. РФ №2126152, опубл. 10.02.1999). В крови спортсмена определяют НСТ-восстанавливающую активность нейтрофилов, значение уровня биурет-положительных средних молекул, значение изопропанол-растворимых продуктов перекисного окисления липидов, количество ретикулоцитов, рассчитывают показатель риска развития острых респираторных заболеваний, подставляя значение полученных показателей в уравнение

А=-12,6·X₁+3,9·Х₂-0,16Х₃-0,02·Х₄+0,5,

где А – показатель риска развития острых респираторных заболеваний,

X₁ – содержание биурет-положительных средних молекул в крови;

X₂ – содержание первичных изопропанолрастворимых продуктов перекисного окисления липидов в крови;

Х₃ – количество ретикулоцитов;

Х₄ – НСТ-восстанавливающая активность нейтрофилов. Развитие острого респираторного заболевания прогнозируют при значении А меньше нуля.

Однако метод также является инвазивным, используемые методы анализа затратны и трудоемки, могут использоваться в специально оснащенных научных лабораториях.

Известен способ прогнозирования частоты рецидивов инфекционных заболеваний дыхательных путей и стойкости эффекта оздоровления дошкольников (п. РФ №2169923, опубл. 27.06.2001). Способ заключается в том, что у ребенка в период реконвалесценции после инфекционного заболевания дыхательной системы определяют наличие условно-патогенной микрофлоры (УПФ) в кале, лейкоцитарную формулу крови, уровни иммуноглобулинов (Ig) A, M, G, оценивают состояние бактерицидной функции нейтрофилов периферической крови с помощью НСТ-теста и фагоцитарную активность нейтронов, выявляют наличие коррелятивной связи между следующими парами показателей: – УПФ-IgA; – процентное содержание лейкоцитов – процентное содержание моноцитов; – процентное содержание лейкоцитов – процентное содержание нейтрофилов; – процентное содержание эозинофилов – абсолютное содержание лейкоцитов в 1 мм крови; – процентное содержание лимфоцитов; – процентное содержание моноцитов; – процентное содержание лимфоцитов – процентное содержание нейтрофилов; – процентное содержание нейтрофилов – процентное содержание эозинофилов; – процентное содержание лимфоцитов – процентное содержание эозинофилов; – IgA – IgM; – IgA – IgG; – IgM – IgG; – IgM – процентное содержание фагоцитирующих клеток; – НСТ спонтанный – НСТ стимулированный; – НСТ спонтанный – процентное содержание лимфоцитов; – НСТ стимулированный – процентное содержание эозинофилов; – НСТ стимулированный – IgM, и при наличии 10 и более связей с силой корреляции менее 0,5, определяют напряженность иммунной системы, прогнозируют нестойкий клинический эффект оздоровления и предрасположенность к частым рецидивам инфекционных заболеваний дыхательной системы.

Однако способ является трудоемким, инвазивным, требующим достаточного количество крови, серьезного лабораторного оснащения.

Таким образом, все представленные ранее методы инвазивны: требуют взятия крови, в некоторых случаях и венозной, что травматично для ребенка; большинство из них требуют серьезного лабораторного обеспечения (наличия в данном учреждении клинической, в некоторых случаях бактериологической, иммунологической, научной лаборатории), материальных вложений, что, безусловно, ограничивает их применение как скринингового метода ранней диагностики в больших группах детей, в организованных коллективах. Хотя известно, что именно в организованных коллективах респираторная заболеваемость достаточно высока.

Общеизвестны такие факторы риска возникновения респираторной патологии как: отягощенная наследственность по патологии органов дыхания, неблагоприятное течение внутриутробного периода, курение как активное, так и пассивное, неудовлетворительные материально-бытовые условия, дефицитные состояния, ранее перенесенные болезни бронхолегочной системы, частые острые респираторные заболевания. (Шабалов Н.П., «Детские болезни», – издательство «Питер», 2002, том 1, с.352).

Существуют попытки поиска неинвазивных методов диагностики различных заболеваний, например, путем исследования биологических жидкостей организма, полученных атравматичными способами.

Одним из таких показателей является уровень средних молекул (УСМ) – маркеров эндогенной интоксикации. Понятие “средние молекулы” (СМ) включает в себя более сотни веществ как экзогенной, так и эндогенной природы. Биологические последствия действия молекул средней массы весьма драматичны – нарушение микроциркуляции и гемолиз эритроцитов, угнетение эритропоэза, развитие вторичной иммунодепрессии, угнетение синтеза белка, замедление тканевого дыхания и синтеза АТФ, сопровождающееся нарушением активного транспорта ионов, исчезновением ионных градиентов на клеточных мембранах и активацией процессов деструкции клеток (С.Г.Галактионов, В.В.Николайчик, В.М.Цейтин и др. «Средние молекулы – эндотоксины пептидной природы», – Хим. фарм. журнал, 1983, т.17, №11, стр.1286-1293). Таким образом, диагностическое значение этого показателя велико при токсикозах различной этиологии, при которых в организме усилено образование как СМ белковой природы, так и низкомолекулярных веществ непептидного происхождения.

УСМ в клинике чаще всего измеряют в сыворотке крови или в плазме, реже проводят определение содержания СМ в эритроцитах и моче. На определении суммарной концентрации СМ в биологических жидкостях основан один из способов регистрации уровня токсемии, предложенный Н.И.Габриэлян, В.И.Липатовой («Лабораторное дело», №3, 1984, стр.138-140).

Уже около 30 лет проводятся исследования свойств конденсата паров выдыхаемого воздуха (КВВ) при различных заболеваниях. Изучаются физические, физико-химические, биологические и биохимические показатели КВВ. Способ исследования поверхностно-активных свойств легкого разработан Г.И.Сидоренко и соавт. в 1980 году. Была выявлена взаимосвязь выдыхаемой жидкости с поверхностно-активными веществами легкого (сурфактант), выстилающими поверхность альвеол. КВВ является объектом исследования метаболической активности легких. Было выявлено, что воспалительный процесс в органах дыхания сопровождается изменениями биохимических параметров КВВ, имеющими прямую зависимость от характера и тяжести заболевания. Эти изменения свидетельствуют о мембранодеструкции, нарушении микроциркуляции и метаболизма (М.А.Хасина, С.А.Двинская, С.И.Белоглазова, М.Ю.Хасина, Т.Ф.Пучинская. Конденсат паров выдыхаемого воздуха в оценке степени нарушения метаболизма бронхолегочной системы при неспецифических заболеваниях легких. 2004. С.15-17).

Поверхностная активность КВВ – показатель функциональной состояния легочного сурфактанта, поэтому особенно ценна оценка данного показателя в режиме экспресс-диагностики.

Самый распространенный белок в организме – коллаген. Вместе с другими компонентами он образует коллагеновые волокна, составляющие основную массу соединительной ткани организма (К.Н.Зеленин. Общая и биоорганическая химия. 2003. стр.540). Поддерживающая сеть тонких коллагеновых волокон располагается вокруг альвеол (Ю.И.Афанасьев. Гистология, цитология и эмбриология. С.639, 2004). Нарушение катаболизма коллагена ведет к функциональным нарушениям бронхолегочной системы, далее к фиброзу. Критерием динамики изменения количества коллагена в биологических жидкостях может быть коллагеназная активность, т.е. активность фермента, разрушающего коллаген. Следует отметить тканевую специфичность как коллагена, так и коллагеназы соответственно. Поэтому коллагеназную активность можно считать одним из специфических маркеров функционального состояния легочной ткани.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения лиц, предрасположенных к респираторным заболеваниям, по энзиматическому ответу лимфоцитов (а.с. СССР №1698764, опубл. 05.10.1988). Способ включает определение энзиматического ответа на ПГЕ₁ в гомогенате лимфоцитов биолюминисцентным методом и по снижению энзиматического ответа глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы и/или увеличению ответа лактатдегидрогеназы, или увеличению ответа малатдегидрогеназы испытуемых лиц относительно референтной группы определяют лиц, предрасположенных к респираторным заболеваниям. Обнаружено, что у лиц, предрасположенных к респираторным заболеваниям, энзиматический ответ Г-6-ФДГ и ЛДГ выше по сравнению с энзиматическим ответом лимфоцитов референтной группы, а ответ МДГ снижен. У лиц, часто страдающих респираторными заболеваниями, выявлены обратные изменения: ответы Г-6-ФДГ и ЛДГ лимфоцитов испытуемых снижены, а ответ МДГ увеличен.

Однако предлагаемый способ является инвазивным, сложным в исполнении, что не позволяет использовать его как экспресс-метод для скрининговых исследований.

Задача изобретения – разработка неинвазивного экспресс-метода для скринингового отбора подростков в группу риска по развитию респираторной патологии за счет выявления нового комплекса значимых биохимических показателей.

Поставленная задача достигается способом отбора подростков 10-20 лет в группу риска по развитию респираторной патологии, при котором определяют такие биохимические показатели как уровень средних молекул мочи (УСМ), поверхностную (ПА) и коллагеназную (КА) активность конденсата паров выдыхаемого воздуха (КВВ), и в случае, если значения УСМ и КА не менее чем на 10% и КА КВВ не менее чем на 15% выше, а значение ПА КВВ не менее чем на 10% ниже уровней данных показателей здоровых, подростка относят в группу риска.

Для сокращения времени обследования и своевременного принятия необходимых профилактических мер при скрининговом обследовании большой группы подростков, например, в организованных коллективах, особенно во вновь образовавшихся (школы, оздоровительные центры, при поступлении на военную службу) целесообразно предварительно провести отбор подростков, имеющих как минимум один из общепринятых факторов риска, затем выделить из отобранной группы подростков, имеющих повышенное значение УСМ в моче, и только потом у подростков выделенной группы определять ПА и КА КВВ.

Предложенное решение представляет собой простой, доступный для массовых исследований, неинвазивный, быстрый, атравматичный, высокоспецифичный способ выявления подростков 10-20 лет с повышенным риском развития респираторных заболеваний, что и является техническим результатом изобретения.

Применение данного способа позволяет своевременно провести необходимый комплекс лечебно-профилактических мероприятий, а следовательно, позволяет добиться снижения респираторной заболеваемости, облегчения их течения, предотвращения осложнений.

Способ осуществляют следующим образом.

Подросток, как правило, имеющий один из общепринятых факторов риска развития респираторной патологии, таких как отягощенная наследственность по патологии органов дыхания, неблагоприятное течение внутриутробного периода, курение родителей и самого подростка, неудовлетворительные материально-бытовые условия, дефицитные состояния, ранее перенесенные пневмонии, частые острые респираторные заболевания, хронические заболевания ЛОР-органов, направляется на анализ мочи, в котором определяют УСМ, а затем исследуют ПА и КА КВВ. При высоких относительно контрольной группы величинах УСМ и КА КВВ и низкой ПА КВВ подростка относят к группе риска по развитию патологии органов дыхания.

За норму принимают величину усредненных показателей, полученных у подростков, которые были здоровы на момент исследования и в последующие 3 месяца.

Используемый для предлагаемого способа отбора комплекс значимых биохимических показателей был получен на основе экспериментальных исследований.

Было проведено обследование 300 подростков в возрасте 10-20 лет из организованных коллективов г.Владивостока – детский оздоровительный центр “Океан”, Тихоокеанское высшее военно-морское училище, Кадетский корпус.

Выявление возможных общепринятых факторов риска проводилось с использованием анкетного опроса, анализа “Историй развития ребенка” (форма 112-у) и “Медицинских карт ребенка” (форма 026/у-2000). Все обследованные были разделены на 2 группы: 1 группа – относительно здоровых – 214 человек (контрольная), 2 группа – подростки, во время или сразу после обследования перенесших острое респираторное заболевание, в том числе пневмонию или бронхит – 86 человек. Всем было проведено биохимическое исследование мочи (УСМ) и КВВ (ПА и КА).

Определение уровня средних молекул (УСМ) мочи.

Мочу центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин. К 0.5 мл осветленного субстрата мочи добавить 0.25 мл 10% ТХУ (трихлоруксусная кислота). Содержимое пробирок встряхивали и центрифугировали 30 минут при 3000 об/мин, на настольной центрифуге MPW-310 (Польша). 10 мкл полученного супернатанта каждой пробы переносили в ячейку кварцевого планшета, содержащую 190 мкл дистиллированной воды.

Оптическую плотность полученного раствора определяли на микропланшетном спектрофлуориметре Quant (Biotek Instruments Inc., США) при 254 нм. Условная единица измерения численно равна коэффициенту экстинции при длине светового луча в 0,5 см.

Для оценки состояния сурфактантной системы был применен метод количественной оценки сурфактанта в экспирате, позволяющий оценивать его поверхностную активность (ПА) в режиме экспресс-диагностики. Интенсивность солюбилизации Судана, являющегося специфическим красителем для липидов, косвенно отражает ПА экспирата и, следовательно, сурфактанта. Смесь КВВ с сухим Суданом в количестве 2 мл и 12 мг соответственно помещали в 10 мл стеклянные флаконы, плотно закрытые полиэтиленовыми пробками и выдерживали в течение 24 часов при комнатной температуре. Затем встряхивали 60 минут на аппарате Шута и центрифугировали 15 минут при 4000 об/мин для осаждения нерастворившегося красителя. Надосадочную жидкость осторожно переносили в чистые пробирки и колориметрировали на аппарате ФЭК при зеленом светофильтре ( – 540 нм). В качестве контроля использовали воду. Поверхностную активность выражали в условных единицах, полученных умножением результатов оптической плотности на 1000.

Определение коллагеназной активности КВВ

Стандартная реакционная смесь содержала 50 мкл пробы (экспирата), 50 мкл 0,005М фосфатного буфера рН 7,4 и 50 мкл n-нитрофенилового эфира N-карбобензилокси-L-фенилаланина. Инкубацию проводили при 37°С. Реакцию гидролиза хромогенных субстратов останавливали добавлением 50 мкл 0,5 М Na₂CO₃. Единица измерения – усл.ед. За единицу ферментативной коллагеназной активности принимали количество фермента, гидролизующего хромогенный субстрат с образованием 1 мкмоля n-нитрофенола за 1 час при 37°С.

Полученные данные были сведены в таблицу и проанализированы с использованием параметрических методов статистики.

Достоверно определено, что значения УСМ во 2 группе превысили УСМ в 1 (контрольной) группе: 2,91±0,12 и 2,49±0,03 (=+0,001), соответственно, ПА КВВ во 2 группе достоверно ниже, чем в 1 группе: 96,4±2,75 и 109,02±4,85 (=+0,05), соответственно, а КА КВВ значительно выше во 2 группе по сравнению с первой: 3,82±0,16 и 2,95±0,03 (=+0,001), соответственно.

Полученные данные позволяют использовать выявленные значимые показатели для отбора подростков с риском развития респираторной патологии. УСМ у подростков из группы риска на 10% и более превышает данный показатель в контрольной группе, КА – на 15% и более, ПА – на 10% и более в группе риска по сравнению с контрольной.

Таким образом, факторами включения в группу риска являются: высокие показатели УСМ в моче и КА КВВ по сравнению с группой здоровых и низкая ПА КВВ по сравнению с группой здоровых.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Клопов Женя, 12 лет. Наблюдается с диагнозом: хронический тонзиллит (т.е. из группы риска). Биохимические показатели: УСМ в моче составил 2,95 при норме – 2,49±0,03 превышение на 18,5%, ПА КВВ – 94,3 при норме -109,02±4,85, что на 13,5% выше нормы, КА КВВ – 3,88 (норма – 2,95±0,03) выше на 24%. В день исследования появились симптомы острого респираторного заболевания: умеренная интоксикация в виде слабости, субфебрильной температуры, явления ринита, нечастый малопродуктивный кашель.

Пример 2.

Семуков, 18 лет. Курит (группа риска). Биохимические показатели: УСМ – 3,01 – на 20,9% выше нормы, ПА – 94,0 у.е. – на 13,8% ниже нормы, КА – 3,91 у.е. – на 24,6% выше нормы. Через день после обследования заболел бронхитом: симптомы интоксикации в виде фебрильной температуры, слабости, частый продуктивный кашель, аускультативно – разнокалиберные влажные хрипы с обеих сторон.

Формула изобретения

1. Способ отбора подростков 10-20 лет в группу риска по развитию респираторной патологии по биохимическим показателям, отличающийся тем, что в качестве биохимических показателей используют уровень средних молекул в моче (УСМ), поверхностную (ПА) и коллагеназную (КА) активность конденсата паров выдыхаемого воздуха (КВВ), и в случае, если значения УСМ не менее чем на 10% и КА КВВ не менее чем на 15% выше, а значение ПА КВВ не менее чем на 10% ниже уровней данных показателей здоровых, подростка относят в группу риска.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что предварительно проводят отбор подростков, имеющих как минимум один из общепринятых факторов риска.