Патент на изобретение №2159128

(54) ОРАЛЬНАЯ ХИМИЧЕСКАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ХОЛЕРЫ

(57) Реферат:

Изобретение предназначено для специфической профилактики холеры, вызванной эпидемически значимыми штаммами НАГ вибрионов 0139 серовара. Вакцина содержит анатоксин холерогена и О-антиген из штамма V. cholerae 569В Инаба и антигенный иммуногенный комплекс. Иммуногенный комплекс получен из культуральной жидкости штамма V. cholerae 0139 серовара. Он состоит из основного соматического О-антигена липополисахаридной природы 0139 серовара с мол. массой 1000 кД, гликопротеидной капсулы 0139 серовара с мол. массой 600 кД и белковых экзоферментов 0139 серовара с мол. массой 100-200 кД. Из экзоферментов она содержит нейраминидазу, фосфолипазу, липазу, протеазу. При необходимости вакцина содержит наполнитель для таблеток или капсул (крахмал, сахар, стеарат кальция или тальк). Вакцина создает защиту от эпидемически опасного штамма холерного вибриона 0139 серовара. 1 ил., 3 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к производству бакпрепаратов для специфической профилактики холеры, вызванной эпидемически значимыми штаммами НАГ вибрионов 0139 серовара.

Штаммы V. cholerae 0139 серовара продуцируют также полисахаридную капсулу, которая вносит вклад в случаи септицемии, описанные с этой серогруппой. Известно, что капсульный полисахарид помогает адгезии к эпителиальным клеткам, играет роль в иммуногенезе (Hisatsune К., Kondo S., Issuki Y., lguchi Т. , Kavamota Y., Shimada T. / Biochem.-Biophys.-Res.-Commun. 1993, N 196(3). P. 1309-15; Knirel Y.A., Paredes L., Jansson P.E., Weintraub A., Widmalm G., Albert M.G. / Eur. J. Biochem., 1995, N 233(2). P. 391-6).

В то же время перекрестного иммунитета с типичными возбудителями холеры 01 серовара не создается, в связи с этим ВОЗ дала заключение о непригодности существующих коммерческих холерных вакцин, изготовленных из штаммов V. cholerae 01 серовара для защиты от заражения штаммами V. cholerae 0139 серовара и важности создания оральной вакцины против штаммов данного серовара (Weekly epidemiological record, N 24, 1998).

Имеются сообщения о конструировании потенциально вакцинных штаммов для создания живой вакцины против штаммов 0139 серовара: парентеральная иммунизация кроликов рекомбинантным штаммом индуцировала высокие титры антител против ЛПС и капсульного полисахарида (Infection and Immunity, 1996. Vol. 64, N 9).

Наиболее близким аналогом к заявляемой вакцине является химическая вакцина, состоящая из анатоксина холерогена вместе с О-антигеном серовара Инаба. Способ ее производства заключается в последовательном фракционировании сульфатом аммония из культуральной жидкости штамма Инаба соматического О-антигена Инаба между 0,2 и 0,35 насыщения и анатоксина холерогена между 0,35-0,8 насыщения с последующей диализацией, лиофилизацией и конструированием таблетированного препарата с нанесением кислотоустойчивого покрытия в таблетки, содержащие 100000 ЕС анатоксина и 1000 усл. ед. О-антигена Инаба (обратный титр РПГА) (патент России N 2076734, A 61 K 39/00).

Данная вакцина создает специфическую защиту от заражения холерными вибрионами 01 серовара, однако не оказывает защитного действия против штаммов 0139 серовара, как и все другие известные противохолерные вакцины.

Задачей изобретения является создание оральной химической вакцины, защищающей от эпидемически опасного штамма холерного вибриона 0139 серовара.

Сущность изобретения заключается в том, что в состав оральной химической вакцины против холеры, содержащей анатоксин холерогена и О-антиген из штамма V. cholerae 569В Инаба, дополнительно введен антигенный иммуногенный комплекс, полученный из культуральной жидкости штамма V. cholerae 0139 серовара, состоящий из основного соматического О-антигена липополисахаридной природы 0139 серовара с мол. массой 1000 кД, гликопротеидной капсулы 0139 серовара с мол. массой 600 кД, белковых экзоферментов 0139 серовара (нейраминидазы, фосфолипазы, липазы, протеазы) с мол. массой 100-200 кД. При необходимости заявляемая вакцина содержит наполнитель для таблеток или капсул.

Заявляемая вакцина представляет собой бивалентную вакцину, состоящую из анатоксина холерогена, являющегося общим антигеном для сероваров 01 и 0139 и О-антигена штамма 0139 серовара, специфического для представителей 0139 серовара. Кроме того, заявляемая вакцина имеет в своем составе О-антиген Инаба, который повышает иммунологическую активность вакцины, сорбируется на анатоксине холерогена и удаление его снижает выход и активность препарата.

Заявляемое изобретение будет представлено с помощью чертежа с графиком, иллюстрирующим инфракрасный спектр О-антигена, входящего в заявляемую вакцину, и таблиц 1-3, где в табл. 1 представлены сравнительные данные состава культуральной жидкости штаммов холерного вибриона 01 и 0139 сероваров путем ультрафильтрации через мембраны амикон; в табл. 2 представлены результаты выделения О-антигенов штаммов-продуцентов 01 и 0139 сероваров из культуральной жидкости; в табл. 3 представлен химический состав и серологические свойства фракции, выделенной из штамма 0139 серовара.

Признаки, отличающие заявляемую вакцину, заключаются в особенности строения О-антигена штамма 0139 серовара, его меньшей молекулярной массе и наличии гликопротеидной капсулы. В табл. 1 для сравнения представлен состав культуральной жидкости штаммов холерного вибриона 01 серовара (наиболее близкого аналога) и 0139 серовара. Как видно, 100% О-антигена у штамма 01 серовара было задержано на высокомолекулярных мембранах (300ХМ и 100ХМ), т.е. имел мол. массу более 100 кД, тогда как у штамма 0139 серовара основная масса О-антигена была задержана на мембране 50РМ, т.е. мол. масса ниже. Для получения О-антигена 0139 штамма был использован иной путь осаждения, интервал фракционирования составил 20-80%, а не 50-80%, как для 01 серовара (табл. 2).

В результате медико-биологические свойства заявляемой вакцины отличаются от свойств наиболее близкого аналога.

1. Для получения заявляемой вакцины фракционирование О-антигена ведут в интервале 0,2-0,8 насыщения, так как учитывается молекулярная масса препарата.

2. Полученный компонент вакцины содержит значительное количество 3,6-дидезоксигексозы, что свидетельствует о наличии капсулы и не характерно для штаммов 01 серовара холерного вибриона.

Способ получения заявляемой вакцины.

В качестве продуцента оральной холерной химической вакцины используют штаммы холерного вибриона 0139 серовара (например, М045, Р16064 и подобные им). Для второго компонента вакцины, содержащего анатоксин холерогена и О-антиген Инаба в качестве продуцента применяют токсигенный штамм холерного вибриона 01 серовара (например, 569В и др.) и получают данный компонент вакцины в соответствии со способом, изложенным в патенте России N 2076734, A 61 K 39/00.

Холерный вибрион 0139 серовара выращивают при температуре 37^oC в реакторе на среде из ферментативного гидролизата казеина (pH 8,0, 200 мг% аминного азота, Na₂HPO₄ – 0,05%, NaCl – 0,5%) в условиях глубинного культивирования с подкормкой глюкозой и аммиаком. В стационарной фазе роста (10-11 ч выращивания), когда концентрация микробных тел, достигнув 70-80 млрд. в мл, оставалась постоянной в течение 3 часов, выращивание прекращают добавлением 0,6% – 0,2% формалина. Содержание растворенного в культуральной жидкости О-антигена в это время по реакции диффузионной преципитации с О-сывороткой составляет 4-8 усл. ед. (обратный титр реакции диффузионной преципитации в геле). Убитые микробные тела через 12 ч отделяют центрифугированием при 15000 об/мин, а надосадочную жидкость выдерживают 30 сут при температуре (10-12)^oC для снижения токсичности О-антигена. После этого приступают к выделению О-антигена из культуральной жидкости. В реактор-осадитель на первом этапе добавляют сульфат аммония до 0,2 насыщения (152 г соли на 1 л), перемешивают, оставляют на 18-20 ч при 18-22^oC и центрифугируют на СГО-100 при 8000 об/мин. Образовавшийся осадок балластной фракции отбрасывают и вновь добавляют сульфат аммония до 0,8 насыщения (456 г соли на 1 л). После центрифугирования осадок диализуют против воды. Раствор О-антигена разводят дистиллированной водой (в среднем до объема 4-5 л), разливают в стерильные емкости по 250 мл и проводят стерилизацию текучим паром в течение 30 мин или добавлением мертиолята натрия в концентрации 1:10000 – 1:20000. В дальнейшем жидкий препарат лиофильно высушивают и используют для конструирования таблетированной вакцины.

Химический состав и серологические свойства фракции, выделенной из штамма 0139 представлены в табл. 3.

Анализ инфракрасного спектра препарата 0139, регистрацию которого проводили в границах 400-4000 см^-1 (фиг.1), позволил выявить в препаратах полосы поглощения, характерные для полисахаридов (область спектра от 700 до 1450 см^-1). Имеется также полоса поглощения 1540 см^-1, принадлежащая деформационным колебаниям связей NH в белках. У препарата выражена полоса поглощения 1740 см^-1, находящаяся на плече интенсивной полосы 1670 см^-1, связанная с наличием липидов. В области 2800-3000 см^-1 четко выделяются полосы валентных колебаний CH₂ групп жирных кислот. Таким образом, данные ИК-спектроскопии препаратов коррелировали с результатами химического анализа и подтверждают липополисахаридную природу полученного препарата.

Моносахаридный состав данного препарата, изученный методом тонкослойной хроматографии, был представлен галактозой, глюкозой, маннозой, рибозой и 3,6-дидезоксигексозой, предположительно являющимся компонентом капсульного полисахарида.

Содержание экзоферментов во фракции составляло: 32 ед./мг протеиназы и 410 ед. /мг фосфолипазы. Токсичность препарата по LD₅₀ для белых мышей, составлявшая в среднем при подкожном введении 1,2 мг, была вдвое ниже, чем у коммерческой оральной вакцины из штамма 01 серовара. Иммуногенность этого препарата, его ED₅₀ для белых мышей при заражении 100 dсl штамма 0139 составляла 3-5 мкг, что соответствовало защитной способности коммерческой вакцины против заражения штаммами холерного вибриона 01 серовара.

Вакцина содержит в 1 таблетке 100000 ЕС холерного анатоксина, 1000 усл. ед. О-антигена 139 серовара, 1000 усл. ед. Инаба (обратные титры РПГА и РИД), наполнитель (крахмал, сахар, стеарат кальция, тальк), покрыта кислоторезистентной оболочкой (возможно использование капсул).

Формула изобретения

Оральная химическая вакцина против холеры, содержащая анатоксин холерогена и О-антиген из штамма Vibrio cholerae 569B Инаба, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антигенный иммуногенный комплекс, полученный при культивировании штамма Vibrio holerae 0139 серовара, состоящий из основного соматического О-антигена липополисахаридной природы 0139 серовара с молекулярной массой 1000 кД, гликопротеидов капсулы 0139 серовара с молекулярной массой 600 кД, белковых экзоферментов 0139 серовара с молекулярной массой 100 – 200 кД, и, при необходимости – наполнитель для таблеток или капсул.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 25.02.2004

Извещение опубликовано: 27.12.2004 БИ: 36/2004