Патент на изобретение №2310861

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ ПСЕВДОТУМОРА ОРБИТЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для прогноза течения псевдотумора. Сущность способа: определяют фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) в сыворотке крови и слезной жидкости. При содержании VEGF от 710 до 820 пкг/мл в сыворотке крови и 400-470 пкг/мл – в слезной жидкости прогнозируют среднетяжелое течение. При содержании VEGF от 360 до 470 пкг/мл в сыворотке крови, 240-310 пкг/мл – в слезной жидкости прогнозируют легкое течение псевдотумора орбиты. Использование способа позволяет повысить точность прогнозирования клинического течения псевдотумора орбиты, что способствует проведению адекватной медикаментозной терапии, сокращению сроков лечения и более высоким функциональным результатам.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”suspected sarcoidosis. Arch. Pediatr. 1996, Jul; 3(7), p.697-700. реф. Найдено из БД Entres PubMed, PMID: 8881183. [Найдено 20.04.2007]. [он-лайн]. SHI J.Т. et al. Clinical and pathologic analysis of orbital pseudotumor. Zhonghua Yan Ke Za Zhi. 2003 Feb, 39(2), p.81-86. реф. Найдено из БД Entres PubMed, PMID: 12783685. [Найдено 20.04.2007]. [он-лайн].

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано при диагностике и прогнозе течения псевдотумора орбиты.

Псевдотумор – это идиопатическое неспецифическое неинфекционное воспалительное заболевание, поражающее все мягкотканые структуры орбиты. Среди причин, вызывающих синдром экзофтальма, псевдотумор занимает второе место по частоте после опухолей орбиты (Офтальмоонкология. Руководство для врачей. Под рук. Бровкиной А.Ф., М., Медицина, 2002 г., стр. 411-415). Псевдотумор нередко является причиной экзентераций орбиты и приводит к потере зрительных функций и инвалидизации больного.

Эффективная диагностика и лечение этой патологии являются одной из важных проблем офтальмологии. Сложность дифференциальной диагностики обусловлена сходностью клинической картины псевдотумора орбиты с истинными новообразованиями.

В настоящее время по Kanski различают легкое, среднетяжелое и тяжелое течение псевдотумора. Способы и эффективность лечения зависят от степени выраженности патологического процесса.

Известно, что при диабете, воспалительных и опухолевых заболеваниях развивается патологический ангиогенез. В молекулярной теории ангиогенеза фактор роста эндотелия сосудов занимает одну из ключевых позиций. Имеются сведения об определении фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) при опухолях различной локализации и генеза (Стимуляторы ангиогенеза – фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиогенин (Ang) и ингибитор апоптоза – растворимый Fas-антиген (sFas) в сыворотке крови больных остеосаркомой и опухолью Юинга. Н.Е.Кушлинский и др. Сборник научных трудов. Челябинск, 2002, стр. 63-64).

Наиболее близким по технической сущности является способ прогноза клинического течения увеальной меланомы, заключающийся в определении содержания VEGF (В.Г.Лихванцева. Современные направления развития проблемы оптимизации эффективности лечения внутриглазных опухолей. Достижения и перспективы офтальмоонкологии. Сб. тр. Юбилейной научно-практической конференции. Москва, 2001 г. Стр.63-72; В.Г.Лихванцева и др. Особенности ангиогенеза у больных с УМ при первично-множественных опухолях. Сб. тр. Юбилейной научно-практической конференции. Москва, 2001 г., стр. 15-19).

Способ заключается в следующем. Авторы изучали количественные показатели фактора ангиогенеза VEGF на срезах с увеальной меланомой. Иммуногистохимические исследования проводили на парафиновых блоках толщиной в 3 микрона с использованием моноклональных антител (AT) VEGF. Реакцию оценивали с применением светового микроскопа.

Недостатком данного способа является то, что авторы прогнозировали клиническое течение увеальной меланомы по содержанию фактора роста эндотелия сосудов в операционном материале, то есть непосредственно в опухолевой ткани больных. Однако в результате хирургического вмешательства, связанного с удалением опухоли, а также на этапе обработки опухолевой ткани для световой микроскопии показатель фактора роста эндотелия сосудов может меняться, что приводит к получению недостоверной информации. По данным авторов фактор роста эндотелия сосудов в срезах увеальной меланомы обнаружен в 62,5% случаев.

Техническим результатом изобретения является получение критериев степени тяжести течения заболевания, а соответственно выбора адекватной тактики лечения и фармакотерапии различных течений псевдотумора орбиты.

Технический результат изобретения достигается способом прогнозирования клинического течения псевдотумора орбиты, включающим определение фактора роста эндотелия сосудов, отличающимся тем, что в сыворотке крови и слезной жидкости VEGF определяют и при его содержании от 710 до 820 пкг/мл в сыворотке крови, 400-470 пкг/мл в слезной жидкости прогнозируют среднетяжелое течение; при содержании VEGF от 360 до 470 пкг/мл в сыворотке крови, 240-310 пкг/мл – в слезной жидкости прогнозируют легкое течение псевдотумора орбиты.

Преимуществом предлагаемого способа прогнозирования течения псевдотумора орбиты является однократное определение содержания фактора роста эндотелия сосудов VEGF в сыворотке крови и слезной жидкости без оперативного вмешательства и необходимости обработки опухолевого материала для анализа, а также высокая частота прогноза. Подтверждением высокой эффективности предлагаемого способа прогноза является совпадение содержания VEGF в интервале 710-820 пкг/мл в сыворотке крови и 400-470 пкг/мл в слезной жидкости со среднетяжелым течением псевдотумора орбиты в 96% случаев, а при содержании VEGF в интервале 360-470 пкг/мл в сыворотке крови и 240-310 пкг/мл в слезной жидкости – с легким течением в 88% случаев, а в целом – в 92%.

Предложенный способ прогнозирования клинического течения псевдотумора орбиты осуществляют следующим образом.

Взятие крови без антикоагулянта для получения сыворотки осуществляют натощак из локтевой вены обследуемых в строго стерильных условиях. Слезную жидкость забирают микропипеткой в количестве 1 мл из конъюнктивального мешка.

Определение уровня фактора роста сосудистого эндотелия VEGF в сыворотке крови и слезной жидкости больных проводят методом иммуноферментного анализа с применением стрептавидина в качестве индикаторного фермента с использованием тест-систем CYTELISA (США).

В лунки 1-го порядка микропланшета вносят по 100 мкл лиофилизированный стандарт VEGF в разведении (концентрация 0-10000 пкг/мл). В остальные лунки микропланшета вносят по 50 мкл исследуемых образцов сыворотки крови, слезной жидкости и 50 мкл раствора для разведения, затем в эти лунки добавляют по 25 мкл биотинилированных поликлональных антител к VEGF. Планшет инкубируют 3 часа при комнатной температуре, затем жидкость из лунок удаляют, и планшет 5 раз промывают буфером. Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

В каждую лунку микропланшета вносят по 50 мкл конъюгата стрептавидина. Планшет инкубируют в течение 45 мин при комнатной температуре. Жидкость из лунок удаляют и 5 раз промывают буфером. Планшет сушат путем постукивания по поверхности лабораторного стола, покрытого фильтровальной бумагой.

Во все лунки планшета вносят по 200 мкл смешанного раствора двух цветных реагентов. Микропланшет инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл стоп-реагента в каждую лунку. Общее время постановки исследования 4,5-5 часов.

Учет результатов проводят с использованием автоматического фотометра «Multiscan» при длине волны 490 нм, устанавливают нулевое поглощение по лунке со стандартом 0. Результаты выражают в пкг/мл. Нормальный уровень фактора роста сосудистого эндотелия VEGF в сыворотке крови у практически здоровых лиц (контрольная группа), как правило, у практически здоровых мужчин – 71,52±30,42 пкг/мл и 226,44±18,23 пкг/мл – у женщин. В слезной жидкости здорового глаза содержание VEGF составило 115 пкг/мл.

У 47 больных с псевдотумором орбиты было изучено содержание фактора роста сосудистого эндотелия VEGF в сыворотке крови в острый период заболевания. Взятие крови без антикоагулянта для получения сыворотки осуществляли натощак из локтевой вены обследуемых в строго стерильных условиях. Слезную жидкость в количестве 1 мл забирают микропипеткой из конъюнктивального мешка.

Определение уровня VEGF в сыворотке крови и слезной жидкости больных проводят методом иммуноферментного анализа с применением стрептавидина в качестве индикаторного фермента.

В лунки 1-го порядка микропланшета вносят по 100 мкл лиофилизированный стандарт VEGF в разведении (концентрация 0-10000 пкг/мл). В остальные лунки микропланшета вносят по 50 мкл исследуемых образцов сыворотки крови, слезной жидкости и 50 мкл раствора для разведения, затем в эти лунки добавляют по 25 мкл биотинилированных поликлональных антител к VEGF. Планшет инкубируют 3 часа при комнатной температуре, затем жидкость из лунок удаляют, и планшет 5 раз промывают буфером. Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

В каждую лунку микропланшета вносят по 50 мкл конъюгата стрептавидина. Планшет инкубируют в течение 45 мин при комнатной температуре. Жидкость из лунок удаляют и 5 раз промывают буфером. Планшет сушат путем постукивания по поверхности лабораторного стола, покрытого фильтровальной бумагой.

Во все лунки планшета вносят по 200 мкл смешанного раствора двух цветных реагентов. Микропланшет инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл стоп-реагента в каждую лунку. Общее время постановки исследования 4,5-5 часов.

Учет результатов проводят с использованием автоматического фотометра «Multiscan» при длине волны 490 нм, устанавливают нулевое поглощение по лунке со стандартом 0. Результаты выражают в пкг/мл.

У 26 (55,3%) из 47 больных псевдотумором орбиты содержание VEGF в сыворотке крови было выявлено в пределах 360-470 пкг/мл и в слезной жидкости – в пределах 240-310 пкг/мл. При этом у 24 (92,3%) из них клинически было отмечено легкое течение заболевания. У 2 (7,7%) больных течение псевдотумора орбиты характеризовалось как среднетяжелое.

У 21 (44,7%) из 47 больных псевдотумором орбиты содержание VEGF в сыворотке крови было выявлено в пределах 710-820 пкг/мл и в слезной жидкости – в пределах 400-470 пкг/мл. При этом среднетяжелое течение заболевания наблюдали у 19 (90,5%) из них, у 2 (9,5%) отмечали легкое течение.

Таким образом, предлагаемый способ прогноза течения псевдотумора орбиты являлся правильным у 43 из 47 больных, что было достоверно в 91,5% случаев.

Пример 1. Больная А., 62 года. DS – псевдотумор орбиты. Определение VEGF в сыворотке крови и слезной жидкости проводилось по выше описанной методике. В разгар заболевания содержание VEGF в сыворотке крови было равно 750 пкг/мл, в слезной жидкости – 420 пкг/мл, на основании чего прогнозировали среднетяжелое заболевание. Действительно, в динамике развития заболевания, несмотря на проводимое лечение, было отмечено средняя тяжесть течения. Таким образом, высокое содержание VEGF в сыворотке крови (750 пкг/мл) и слезной жидкости (420 пкг/мл) в острой стадии свидетельствует о среднетяжелом течения псевдотумора орбиты.

Пример 2. Больная Б. DS – псевдотумор орбиты. Определение VEGF в сыворотке крови и слезной жидкости проводилось по вышеописанной методике. Содержание VEGF в сыворотке крови было равно 390 пкг/мл, в слезной жидкости – 260 пкг/мл. На основании установленных в пределах вышеуказанных интервалов (360-470 пкг/мл для сыворотки крови и 240-310 пкг/мл – для слезной жидкости) значений VEGF прогнозировали легкое течение псевдотумора.

Таким образом, предлагаемый способ прогноза течения псевдотумора орбиты позволяет оценить характер течения этого заболевания по изменению содержания VEGF в сыворотке крови и слезной жидкости пациентов. Прогноз течения псевдотумора орбиты при уровне VEGF в интервале 710-820 пкг/мл в сыворотке крови и 400-470 пкг/мл в слезной жидкости оценивается как среднетяжелый, а при содержании VEGF в интервале 360-470 пкг/мл в сыворотке крови и 240-310 пкг/мл в слезной жидкости – как легкий.

Формула изобретения

Способ прогнозирования клинического течения псевдотумора орбиты, включающий определение фактора роста эндотелия сосудов, отличающийся тем, что в сыворотке крови и слезной жидкости определяют VEGF и при его содержании от 710 до 820 пкг/мл в сыворотке крови, 400-470 пкг/мл в слезной жидкости прогнозируют среднетяжелое течение; при содержании VEGF от 360 до 470 пкг/мл в сыворотке крови, 240-310 пкг/мл – в слезной жидкости прогнозируют легкое течение псевдотумора орбиты.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 21.07.2008

Извещение опубликовано: 27.03.2010 БИ: 09/2010