Патент на изобретение №2310196
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СИМПАТО-АДРЕНАЛОВОЙ СИСТЕМЫ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине, а именно к экологической физиологии и эндокринологии. Для определения функциональной активности симпато-адреналовой системы (САС) животных и человека исследуют кровь. Осуществляют приготовление трех проб крови, разведенных в 200 раз, причем первой – с изотоническим раствором хлорида натрия, второй контрольной – с раствором фитогемагглютининов, третьей опытной – с раствором фитогемагглютининов и пропранолола. Инкубируют пробы в течение 10 минут. Подсчитывают под микроскопом в камере Горяева количество свободных неагглютинировавших эритроцитов. Вычисляют показатель активности (АК) по формуле:
где Эр – количество эритроцитов в 0,85% растворе NaCl; Контр. – количество эритроцитов в растворе ФГА; ПП – количество эритроцитов в растворе ФГА и пропранолола. При АК ниже 80% считают САС неактивной. Использование способа позволяет повысить точность оценки САС.
(56) (продолжение): CLASS=”b560m”1989. HOLLENBACH E. et al. Rapid and sensitive determination of catecholamines and the metabolite 3-methoxy-4-hydroxyphen-ethyleneglycol using HPLC following novel extraction procedures. Life Sci. 1998, 63(9), p.737-750, PMID: 9740311, реф., [он-лайн], [найдено 01.09.2006], найдено из базы данных PubMed. EISENHOFER G. et al. Plasma metadrenalines: do they provide useful information about sympatho-adrenal function and catecholamine metabolism? Clin Sci (Lond). 1995, 88(5), p.533-542, PMID: 7614812, реф., [он-лайн], [найдено 01.09.2006], найдено из базы данных PubMed.
Изобретение относится к физиологии и медицине и может быть использовано в экологической физиологии, эндокринологии, а также в клинических и экспериментальных исследованиях для биотестирования различных гормональных и других биологически активных веществ, в том числе и фитоэкдистероидов. Известны радиоиммунологические методы, методы ЯМР и флуоресцентных зондов для определения концентрации свободных и связанных с рецепторами катехоламинов (Справочник практического врача /Под ред. Воробьева А.И. М.: Медицина, 1992). Недостаток этих методов заключается в необходимости использования сложной медицинской аппаратуры, специально оборудованных помещений и специально обученного персонала, дорогостоящих реактивов. Недостаток известного способа заключается в необходимости относительно большого количества крови и сложной математической обработке. Известен способ оценки состояния симпатоадреналовой системы человека (SU 1422158, А1 07.09.1988), выбранный за прототип, сущность которого заключается в следующем. Из крови пациента отделяют эритроциты, трехкратно их отмывают в охлажденном физиологическом растворе, добавляют 8-10 мг ЭДТА к 1-2 мл эритроцитарной взвеси и экстрагируют катехоламины (А и НА) в 0,4 н. надхлорной кислоте в течение 30 мин. После отделения белого хлопьевидного осадка путем центрифугирования сливают полученный супернатант и доводят рН до 8,5. Проводят адсорбционную колоночную хроматографию, в качестве сорбента используя окись алюминия. Проводят элюцию катехоламинов, двукратно добавляя 3,5 мл 0,25 н. уксусной кислоты для получения уксуснокислого элюата и дальнейшего окисления катехоламинов. Элюат окисляют ферроцианидом калия в фосфатном буфере рН 4,2-6,2 для получения продуктов окисления А и НА. Измеряют флюоресценцию А и НА, регистрируют разницу опытных и контрольных проб и по их значению судят о тяжести заболевания. Известный способ является многостадийным и трудоемким, что влияет на точность результатов исследований. Задачей изобретения является разработка нового способа определения состояния симпато-адреналовой системы. Техническим результатом предложенного способа является повышение точности оценки САС, это позволяет использовать способ для мониторинга и экспресс-оценки САС животных и человека. Мембрана эритроцитов содержит Технический результат достигается тем, что в способе определения функциональной активности симпато-адреналовой системы (САС) животных и человека, включающем исследование крови, согласно изобретению осуществляют приготовление трех проб крови разведенных в 200 раз, причем первой – с изотоническим раствором хлорида натрия, второй контрольной – с раствором фитогемагглютининов; третьей опытной – с раствором фитогемагглютининов и пропранолола, инкубацию проб – в течение 10 минут, количественный подсчет под микроскопом в камере Горяева свободных неагглютинировавших эритроцитов, вычисляют показатель активности (АК) по формуле:
где Эр – количество эритроцитов в 0,85% растворе NaCl; Контр. – количество эритроцитов в растворе ФГА; ПП – количество эритроцитов в растворе ФГА и пропранолола, И при АК ниже 80% считают САС неактивной. Способ осуществляется следующим образом. В изобретении используется пропранолол (ПП) – неселективный блокатор Кровь с антикоагулянтом от человека или экспериментального животного, тщательно перемешанную в разведении 200 раз, набирают в эритроцитарные меланжеры и проводят количественное определение реакции агглютинации эритроцитов. В первой пробе кровь разводят с 0,85% NaCl и определяют общее количество эритроцитов. Вторую контрольную пробу разводят раствором ФАГ и определяют количество свободных, не вовлеченных в реакцию агглютинации эритроцитов. Третью опытную пробу разводят раствором ФАГ+ПП и определяют количество свободных эритроцитов. Подсчет эритроцитов, не подвергшихся агглютинации, проводят через 10 минут инкубации под микроскопом в камере Горяева в пяти больших квадратах. Вычисляют количество агглютинировавших эритроцитов по разнице между общим количеством эритроцитов (проба 1) и количеством свободных неагглютинировавших эритроцитов в пробах 2 и 3. Опытная проба 3 позволяет сравнить исходную агглютинабельность контрольного образца в растворе ФГА с имитацией in vitro его состояния при стрессе. По способности
где АК – активность САС; Эр – количество эритроцитов в 0,85% растворе NaCl; Контр. – количество эритроцитов в растворе ФГА; ПП – количество эритроцитов в растворе ФГА и пропранолола. Экспериментально установлено, что симпато-адреналовая система не активирована, если показатель активности ниже 80%, т.е. имеются значительные различия в контрольной и опытной пробах. Пример 1 Берут кровь с антикоагулянтом от интактной крысы, набирают в эритроцитарные меланжеры, при этом кровь набирают до метки 0,5, до метки 101 – раствор ФГА (контрольная проба), опытная проба – ФГА с ПП: до метки 0,5 – кровь, до 1 – ПП с концентрацией 10-6 моль/литр, до метки 101 – раствор ФГА. Содержимое меланжеров в течение этого времени перемешивают. Осуществляют подсчет свободных неагглютинировавших эритроцитов в 5 больших квадратах. Общее количество эритроцитов в 5 больших квадратах Эр. – 495; в контр. – 312, в ПП-пробе – 371.
САС не активирована. Пример 2 Осуществляют оценку САС по вышеописанному способу при введении экспериментальной крысе 20-гидроксиэкдизона (20 Е) в дозе 20 мг/кг из растения серпухи венценосной S. coronata L. (Володин В.В., Володина С.О. Способ получения экдистероидов. Пат.2153346. Россия. МКИ 3 Эр – 571; ПП – проба 399; контроль – 297 эр.
САС не активирована. Пример 3 Осуществляют оценку САС по вышеописанному способу после физической нагрузки (плавание в течение 40 минут) экспериментальной крысе. Эр=480; контр. проба – 247; ПП-проба 273 эр.
САС умеренно активирована. Пример 4 Осуществляют оценку САС по вышеописанному способу при введении экспериментальной крысе тироксина в дозе 30 мг/кг веса. Эр=580; контр. проба 352; ПП-проба 368 эр.
САС значительно активирована. Экспериментально установлено и подтверждено, что чем ближе показатель АК к 100%, тем выше активность САС. Наименьшая активность САС у интактной крысы и у крысы, которой вводился 20-Е; у животных при введении тироксина и физической нагрузке (стрессорный фактор) отмечена более высокая активность САС, максимальная при введении тироксина. Таким образом, предлагаемый способ прост и не требует специальной подготовки и может быть проведен параллельно с клиническим определением общего количества эритроцитов в крови. Способ легко реализуется в обычных клинических лабораториях, не требует сложного оборудования. Необходимое для анализа количество крови можно брать из отходов крови с антикоагулянтом, которые обычно остаются в клинических лабораториях после ряда стандартных анализов, или получать проколом кожи людей, лабораторных и диких животных. Важно лишь, чтобы хранились они без замораживания не более 24 часов после их изъятия из организма. Высокая чувствительность предлагаемого способа допускает применение его для оценки степени адаптированности людей и животных к условиям деятельности и среды обитания, а также функциональных резервов организма.
Формула изобретения
Способ определения функциональной активности симпато-адреналовой системы (САС) животных и человека, включающий исследование крови, отличающийся тем, что осуществляют приготовление трех проб крови разведенных в 200 раз, причем первой – с изотоническим раствором хлорида натрия, второй контрольной – с раствором фитогемагглютининов; третьей опытной – с раствором фитогемагглютининов и пропранолола, инкубацию проб в течение 10 мин, количественный подсчет под микроскопом в камере Горяева свободных неагглютинировавших эритроцитов, и вычисляют показатель активности (АК) по формуле
где Эр – количество эритроцитов в 0,85% растворе NaCl; Контр. – количество эритроцитов в растворе ФГА; ПП – количество эритроцитов в растворе ФГА и пропранолола, и при АК ниже 80% считают САС не активной.
|
||||||||||||||||||||||||||
-адренорецепторы и может отражать состояние адренорецепторов в других органах и тканях. Нами предложено использовать метод фитогемагглютинации в сочетании с ПП-тестом. ПП-тест позволяет сравнить исходный контрольный образец крови с фитогемагглютининами (ФГА) с имитацией in vitro его состояния при стрессе.
