Патент на изобретение №2310195

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ АТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии и микробиологии. Сущность способа заключается в том, что одновременно выделяют эпителиоциты в браш-биоптатах слизистой ротоглотки – материала для интегральной оценки резистентности макроорганизма пациента по показателям, характеризующим микробиоценоз и морфофункциональное состояние слизистой, определяют электрокинетическую активность ядер буккальных эпителиоцитов (ЭлА), индекс инфицирования (ИИ), индекс адгезии (ИА) и берут смывы с пораженных участков кожи, площадью 2 см², в которых определяют количество колониеобразующих единиц (КОЕ) S.aureus/см². При значении индекса инфицирования >70%, индекса адгезии >100-150 микробных клеток S.aureus на эпителиоцит, КОЕ>200/см²² и ЭлА30% при первичном осмотре прогнозируют легкое течение. Использование способа позволяет повысить точность и экспрессность прогнозирования характера течения атопического дерматита. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии и микробиологии, и может быть использовано для прогнозирования течения атопического дерматита.

Атопический дерматит продолжает оставаться одной из актуальных проблем современной дерматологии в связи с ростом заболеваемости, довольно широким распространением в популяции и хроническим течением. Проблема обусловлена не только его высокой распространенностью, но и особенностями течения заболевания, характеризующегося хроническим течением, выраженным кожным зудом, повышением чувствительности к одному или нескольким аллергенам и, в свою очередь, приводящим к социальной дезадаптации и инвалидизации пациентов.

На современном этапе атопический дерматит является одним из наиболее распространенных хронических дерматозов с повышением чувствительности к одному или нескольким аллергенам как инфекционного, так и неинфекционного происхождения, причем роль инфекционных агентов, как факторов, способствующих хронизации процесса и ухудшающих прогноз заболевания, достаточно значительна. Вторичное инфицирование в немалой степени связано с дисфункциями клеточного и гуморального звеньев иммунитета, нарушением синтеза интерферона и функциональной активности естественных киллеров. Основным представителем патогенной аэробной флоры у больных атоническим дерматитом является S.aureus. Обсемененность S.aureus пораженной кожи при атопическом дерматите значительно превышает этот показатель у здоровых лиц. Усиленный рост S.aureus на коже и нарушение целостности эпидермиса приводят к повышению сенсибилизации кожи у больных атопическим дерматитом.

Таким образом, частота распространения, многообразие провоцирующих факторов и условий, хроническое, рецидивирующее течение с осложнениями различной природы определяют необходимость разработки критериев прогноза характера течения атопического дерматита.

Однако данный способ имеет ряд недостатков. Во-первых, он достаточно субъективен, так как при этом способе ряд показателей (нарушения сна, интенсивность кожного зуда) оценивается либо родителями, либо самим пациентом. Во-вторых, метод не достаточно точен, поскольку оценка тяжести и характера течения атопического дерматита проводится на момент обращения пациента в период обострения. Кроме того, описанный метод достаточно трудоемок и не может широко использоваться в практическом здравоохранении, так как предусматривает на первом этапе определение пораженных участков кожи с расчетом площади поражения кожи и интенсивности клинических проявлений с их оценкой по балльной шкале. Кроме того, метод не позволяет точно оценивать тяжесть и прогноз характера течения заболевания.

Описан также способ оценки степени тяжести атопического дерматита, основанный на качественной и количественной оценке структурных компонентов липидной пленки с пораженных участков кожи: фосфолипидов (ФЛ), холестерина (ХС), жирных кислот (ЖК), триацилглицеридов (ТАГ), эфиров холестерина (ЭХС). (Огородова Л.М., Ходкевич Л.В., Нагаева Т.А., Рыжов С.В. Способ оценки степени тяжести атопического дерматита. Регистрационный номер заявки 2002122176/15, дата подачи заявки 15.08.2002, номер патента 2239837).

Однако данный метод также не лишен недостатков. Метод характеризуется трудоемкостью, так как при его осуществлении производится большое количество технологических операций (экстрагирование, центрифугирование, выпаривание, хроматография). Описанный метод отличается и дороговизной, в связи с использованием дорогостоящего оборудования и реактивов. Более того, учитывая общеизвестное положение о триггерной роли определенных микроорганизмов в поддержании патологического процесса при атопическом дерматите, предложенный метод не оценивает роль бактериального фактора, влияющего на характер течения атопического дерматита и, следовательно, не обеспечивает точности прогноза основного заболевания.

Для устранения вышеуказанных недостатков авторы предлагают способ, позволяющий прогнозировать характер течения атопического дерматита, основанный на интегральной оценке микробиологических показателей, характеризующих неспецифическую резистентность кожи и слизистых. А именно, метод предусматривает одновременное определение: 1) электрокинетической активности буккальных эпителиоцитов (ЭлА), позволяющей оценить характер взаимодействия микроорганизма с клеткой “хозяина” в неспецифическую фазу их взаимодействия, 2) индекса инфицирования (ИИ) – процента эпителиальных клеток, пораженных микробом, интегрально-отражающего колонизационную резистентность клеток “хозяина”, 3) индекса адгезии (ИА) – среднего количества прикрепившихся микробных клеток к одной эпителиальной клетке, показателя, характеризующего колонизационную активность S.aureus. Кроме того, предлагаемый метод предусматривает одновременный подсчет количества микробных клеток S.aureus на единицу площади кожи (колониеобразующих единиц – КОЕ/1 см²).

Сущность метода заключается в том, что одновременно выделяют эпителиоциты в браш-биоптатах слизистой ротоглотки – материала для интегральной оценки резистентности макроорганизма пациента по показателям, характеризующим микробиоценоз и морфофункциональное состояние слизистой, определяют электрокинетическую активность ядер буккальных эпителиоцитов (ЭлА), индекс инфицирования (ИИ), индекс адгезии (ИА) и берут смывы с пораженных участков кожи, площадью 2 см², в которых определяют количество колониеобразующих единиц (КОЕ) S.aureus/см². При значении индекса инфицирования >70%, индекса адгезии >100-150 микробных клеток S.aureus на эпителиоцит, КОЕ>200/см² и ЭлА <20% при первичном осмотре прогнозируют тяжелое течение атопического дерматита, при значениях индекса инфицирования <30%, индекса адгезии <50 микробных клеток S.aureus/эпителиоцит, КОЕ50/см² и ЭлА30% при первичном осмотре прогнозируют легкое течение.

Таким образом, авторами впервые предложено оценить колонизационную активность S.aureus 2-х экологических ниш, а также морфофункциональное состояние слизистой буккального эпителия, интегрально отражающего антиинфекционную резистентность организма.

Технический результат заключается в повышении точности и экспрессности.

Кроме того, точность предлагаемого авторами метода достигается использованием количественных показателей, отражающих колонизационную активность S.aureus: 1) на слизистых – определение индекса адгезии (среднее количество прикрепившихся микробных клеток S.aureus к одной эпителиальной клетке); 2) на коже – определение КОЕ S.aureus/см² (колониеобразующих единиц S.aureus на 1 см² кожи). Более того, для объективной оценки антиинфекционной резистентности макроорганизма авторы впервые предлагают учитывать следующие показатели: электрокинетическую активность ядер буккальных эпителиоцитов и индекс инфицирования.

Повышение чувствительности данного метода достигается также благодаря осуществлению следующих технологических приемов. Из пробы браш-биоптатов одновременно готовятся мазки для последующего окрашивания и просматривания препаратов в режиме прямой световой микроскопии, в которых исследуют 50 эпителиоцитов и подсчитывают на каждом из них количество прикрепившихся клеток S.aureus, а также рассчитывают среднее количество прикрепившихся S.aureus к одной эпителиальной клетке (ИА) и процент эпителиальных клеток, пораженных микробом (ИИ), и препараты на предметном стекле для определения электрокинетической активности ядер буккального эпителия на устройстве БЭ-1 (Гончаренко М.С., регистрационный номер заявки 5000616/14, дата подачи заявки 02.07.1991, номер патента 2007113), проводя забор материала в одно и тоже время суток, устраняя неспецифические факторы воздействия.

Предложенный впервые комплекс методических приемов, выполняемых в процессе определения ИИ, ИА, КОЕ/см² и оценки ЭлА, является обязательным. Невыполнение их не позволяет дать объективную оценку тяжести течения атопического дерматита, не обеспечивает точность прогноза. Методика успешно апробирована авторами на материале от 46 больных с диагнозом атопический дерматит в возрасте 15-20 лет, из них 25 – девочки, 21 – мальчики. Пациенты были разделены на 3 группы в зависимости от тяжести течения. Степень тяжести и прогноз заболевания оценивали 2-мя способами: по шкале SCORAD и по предложенному авторами методу. Было проведено сопоставление данных клинического осмотра с данными предложенного способа, а также наблюдение за течением дерматоза в динамике. В процессе наблюдения проводилась оценка состояния электрокинетической активности ядер буккального эпителия и культуральные исследования смывов из очагов поражения и участков здоровой на вид кожи в первый день наблюдения и в дальнейшем с интервалом в 4 недели. В качестве контрольных обследовались 15 условно здоровых лиц 18-20 лет без детской экземы в анамнезе и очагов хронической инфекции (табл.1).

В таблице 1 приведены показатели ЭлА, ИИ, ИА и КОЕ S.aureus/1 см² пораженной кожи у больных атопическим дерматитом различной степени тяжести.

В 1 группе эти показатели составили – ЭлА – 29,67±1,73%; ИИ – 27,18±1,63%; ИА – 25,56±1,50; КОЕ/см² – 48,38±13,65, что соответствовало легкой степени тяжести атопического дерматита,

во 2 группе – ЭлА – 25,58±1,12%; ИИ – 39,42±2,73%; ИА – 54,44±5,07; KOE/см² – 87,68±23,67, что соответствовало средней тяжести течения атопического дерматита;

в 3 группе – показатели ЭлА – 18,0±1,87%; ИИ – 75,92±3,17%; ИА – 110,0±7,38; KOE/см² – 205±58,6 соответствовали тяжелой степени атопического дерматита (р<0,05).

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. У больного АД до начала лечения берут браш-биоптат слизистой ротоглотки и смывы с 2 см ² пораженных участков кожи. Для получения браш-биоптатов слизистой ротовой полости используют щеточку от эндоскопа, укрепленную на держателе для бактериологической петли, что позволяет при однократном заборе получать достаточное количество эпителиальных клеток (>1000000 клеток/мл). Взятый биоптат со щеточки суспендируют в центрифужной пробирке в 1 мл стерильного фосфатно-солевого буферного раствора ФСБ (рН 7,2-7,4), выдерживают в термостате при 37°С в течение одного часа. Неприкрепившиеся к эпителиальным клеткам S.aureus удаляют трехкратным промыванием в ФСБ (рН 7,2-7,4) при 1500 об/мин. С осадка готовят препараты – отпечатки на двух предметных стеклах (тонким слоем, площадью не более 1/2 поверхности предметного стекла). Препарат (первое стекло), предназначенный для определения ИА S.aureus и показателя, выражающего чувствительность эпителиоцитов к адгезии возбудителя, фиксируют 10 мин метиловым спиртом или смесью Никифорова (этиловый спирт и эфир, в соотношении 1:1), затем окрашивают по методу Романовского-Гимзе, используя готовый раствор краски азур-эозин по Романовскому. Препарат красят 30-45 мин. В вертикальном положении промывают водой, дифференцируют под визуальным контролем (5-10 мин) подкисленным этанолом (3-5 капель ледяной уксусной кислоты на 10-20 мл этилового спирта 96°), вновь промывают дистиллированной водой, подсушивают на воздухе. В окрашенных препаратах методом прямой световой микроскопии исследуют 50 эпителиоцитов и подсчитывают на каждом из них количество прикрепившихся клеток S.aureus, учитывают ИА (среднее количество прикрепившихся микробных клеток к одной эпителиальной клетке) и ИИ (% эпителиальных клеток, пораженных микробом). Для выявления S.aureus на коже больных атоническим дерматитом брали смывы с пораженных участков кожи, площадью 2 см² методом бакпечаток (Ленмедполимер, по методике Кпемпарской). С этой целью бакпечатки заполняли селективной средой на основе агара Хоттингера, площадью 2 см². Посев производили методом контакта бакпечатки с пораженным участком кожи в течение 20 секунд. Больные в течении 3-х дней не использовали местные противовоспалительные препараты на коже лица, сгибательной поверхности предплечья, шее, кистях. Чашки инкубировали в термостате в течение суток при t 37°. На следующие сутки осуществляли выделение чистой культуры путем пересева колоний на скошенный агар Хоттингера и идентификацией штаммов по показателям окраски по Граму, бактериоскопического исследования, гемолитической и плазмокоагулирующей активности, реакции ферментирования маннита, способности роста на 10% солевом агаре. Количество колоний определяли на площади 2 см² (соответственно размеру бакпечатки) и вычисляли КОЕ/см². При значении до 50/см² прогнозировали более легкое течение, при значении 200/см² и более – тяжелое течение. Для определения электрокинетической активности ядер клеток буккального эпителия брали материал в одно и тоже время. Пробу клеток получали путем соскоба браш-щеточкой с внутренней стороны щеки. Клетки наносили на чистое предметное стекло, туда добавляли каплю физ. раствора, накрывали покровным стеклом для получения одного слоя клеток. Препарат помещали в камеру с платиновыми электродами, в местах соприкосновения стекол с электродами клали увлажненные полоски фильтровальной бумаги. Камеру закрепляли на предметном столике микроскопа. Выводы электродов подключали к установке стабилизированного источника питания с автоматическим переключением полярности напряжения. Исследования проводили в режиме 28 В/см при силе тока 0,15±0,05 мА, режим регулировали по току. Электрокинетическую активность ядер клеток буккального эпителия выражали в процентах подвижных ядер на 100 исследуемых клеток. У больных атопическим дерматитом в период обострения заболевания процент подвижных ядер (18,00±1,87 при тяжелом течении SCORAD>40; 29,67±1,73 при легком течении SCORAD<20) снижен в более чем 2 раза по сравнению с группой практически здоровых лиц (67,6±2,07). При повторном осмотре через 4 недели на фоне проводимой терапии (десенсибилизирующей, наружной медикаментозной терапии и базовом уходе эмольянтами) данный показатель повысился соответственно до 24,44±1,51 при тяжелом течении, до 40,97±1,12 при легком течении, а в контрольной группе составил 69,60±1,51. Клинические проявления патологии кожи значительно уменьшились в группе с легким течением, при наружном осмотре была неполная клиническая ремиссия.

Предлагаемый способ экспресс-прогноза тяжести течения атопического дерматита, позволяет, основываясь на результатах клинического осмотра и вышеперечисленных микробиологических показателях оценки неспецифической резистентности организма, дать предварительный прогноз тяжести течения уже через сутки после взятия материала.

Предложенный способ может быть использован в практике лабораторий лечебно-профилактических учреждений.

В качестве доказательств приводим следующие примеры:

Пример 1. Больной Н. 20 лет обратился на кафедру дерматовенерологии в СПбМАПО 25.12.04 с диагнозом атопический дерматит. На момент поступления предъявлял жалобы на наличие высыпаний по всему кожному покрову, зуд в местах высыпаний. Давность заболевания около 14 лет, в анамнезе детская экзема. Наследственная отягощенность по материнской линии (у матери отмечается поллиноз, аллергические реакции на антибактериальные препараты пенициллинового ряда). Неоднократно лечился амбулаторно по месту жительства с положительным эффектом от антигистаминных препаратов, диеты, наружного лечения. Последние 3 года отмечает частые обострения после переезда в Санкт-Петербург, особенно в весеннее-осенний период, после погрешностей в диете (цитрусовые, рыба), приеме алкогольных напитков, стрессе. Сопутствующая патология: хронический гастрит, дискинезия желчевыводящих путей, хронический холецистит. На данный момент проживает в коммунальной квартире, где из потенциальных аллергенов имеются домашние животные (кошка, хомяки), шерстяной ковер. Пациент курит около 2-х лет, выкуривая по 1 пачке в день. При объективном исследовании выявлена сухость кожных покровов. Язык обложен серо-желтым налетом. Ротовая полость санирована. Кожный процесс локализуется на коже лица (верхние веки, красная кайма губ), задней поверхности шеи, локтевых сгибов, предплечий, области лучезапястных суставов, подколенных ямок, туловища. На коже лица в области верхних век имеется отечность, шелушение. На задней поверхности шеи на гиперемированном, отечном фоне наблюдались шелушение, лихенификация, экскориации. На туловище имеются очаги гиперемии, шелушения с геморрагическими корочками и экскориациями. На коже локтевых сгибов, подколенных ямок наблюдаются очаги гиперемии, инфильтрации, лихенизации, везикулезно-папулезные элементы, геморрагические корочки. Поставлен диагноз: атопический дерматит распространенный, стадия обострения, тяжелое течение, лихеноидная форма. До лечения был взят клинический анализ крови (эозинофилия 9%), браш-биоптат слизистой ротоглотки, определены ИИ, ИА, ЭлА (ИИ составил около 70%, ИА около 100-150 клеток S.aureus на эпителиоцит, ЭлА 17%), КОЕ составил 218/см². Приведенные показатели коррелировали с тяжестью течения атопического дерматита и не достигали показателей “нормы” даже в период полной клинической ремиссии (около 1,5 месяцев):

ЭлА=24%, ИА около 70 клеток S.aureus на эпителиоцит, ИИ около 40%, КОЕ>100/см² на бакпечатку.

Пример 2. Больная А. 16 лет обратилась на кафедру дерматовенерологии в СПбМАПО 14.09.04 с атопическим дерматитом. На момент поступления предъявляла жалобы на наличие высыпаний на лице, кистях, зуд умеренной интенсивности. Давность заболевания 12 лет, в анамнезе детская экзема, индекс SCORAD<20. В возрасте 3-4 года отмечались аллергические реакции на шоколад, цитрусовые, рыбу, антибиотики. Проводилось эпизодическое амбулаторное лечение, которое давало положительный эффект. Наследственность отягощена по линии отца (экзема кистей, стойкая ремиссия около 15 лет). Из сопутствующей патологии имеется хронический гастрит. При объективном исследовании выявлена сухость кожных покровов. Язык обложен сероватым налетом, полость рта санирована. Кожный процесс на лице в области верхних век и красной каймы губ представлен очагами гиперемии, шелушения на отечном фоне. На коже кистей очаги инфильтрации, папулезные элементы, шелушение, гиперемия, единичные экскориации. Поставлен диагноз: атонический дерматит, стадия обострения, легкое течение (SCORAD<20). У пациентки взяты: клинический анализ крови (эозинофилия 7%), браш-биоптат слизистой ротоглотки, определены ИИ, ИА, ЭлА (ИИ составил около 30%, ИА около 50 клеток S.aureus на эпителиоцит, ЭлА 31%), КОЕ составил 50/см².

В процессе лечения (наружной и системной терапии) полная клиническая ремиссия наступила на 17 день при показателях, достигших практически “нормы” у условно здоровых лиц: ЭлА=44%, ИА около 20 клеток S.aureus на эпителиоцит, ИИ около 30%, КОЕ20/см²

Течение заболевания было более легким, ремиссия около 6,5 месяцев.

Кроме того, предлагаемый метод позволяет оценить морфофункциональное состояние слизистой ротовой полости по следующим закономерностям: наличие разрушенных эпителиоцитов, присутствие мононуклеаров и выраженная вакуолизация эпителиоцитов, наличие полинуклеаров с фагоцитарной активностью. Выявленные морфофункциональные явления состояния буккального эпителия ротоглотки позволяют установить сопутствующую патологию ротоглоточного кольца. Помимо этого, метод позволяет сделать прогноз течения заболевания по оценке местного специфического иммуноглобулина А: иммуноглобулин А отсутствует при тяжелых, осложненных вторичной инфекцией формах, и определяется в достаточной концентрации при легком течении.

Прогностическая ценность метода состоит в том, что выявленные изменения на слизистых предшествуют воспалительным явлениям на кожных покровах. Таким образом, в отличие от других иммунологических методов является более выгодным экономически (IgE может быть повышенным не у всех больных АД, а методика является достаточно дорогостоящей), простым в исполнении, неинвазивным (в отличие от скарификацоинных проб), достаточно объективным (в отличие от одних только клинических данных: индекс SCORAD). Кроме того, преимуществом данного метода является то, что с его помощью можно прогнозировать развитие обострения у больных с отсутствием каких-либо кожных проявлений

Таким образом, предложенный способ обладает преимуществом по сравнению с выявленным прототипом. Способ прост, не требует дорогостоящей аппаратуры, удобен для мониторингового наблюдения за динамикой течения заболевания, является высокоинформативным, может использоваться для оценки проводимой терапии, сокращает время проведения исследования и отличается небольшими расходами на его проведение, а также повышает объективность и точность прогнозирования течения атопического дерматита.

Формула изобретения

Способ прогнозирования течения атопического дерматита путем оценки клинико-анамнестических критериев тяжести и состояния неспецифической резистентности кожи и слизистых, отличающийся тем, что одновременно выделяют эпителиоциты в браш-биоптатах слизистой ротоглотки, определяют электрокинетическую активность ядер буккальных эпителиоцитов (ЭлА) индекс инфицирования (ИИ), индекс адгезии (ИА) и берут смывы с пораженных участков кожи, площадью 2 см², в которых определяют количество КОЕ/см² S.aureus и при значении ИИ>70%, ИА>100-150 микробных клеток на эпителиоцит, КОЕ>200/см² и ЭлА<20% при первичном осмотре прогнозируют тяжелое течение атопического дерматита, а при ИИ<30%, ИА<50 микробных клеток на эпителиоцит, КОЕ<50/см² и ЭлА>30% прогнозируют легкое течение атопического дерматита.