Патент на изобретение №2309406

(54) СПОСОБ МОНИТОРИНГА ФИБРОЗА ПЕЧЕНИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С (ХГС)

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностическим методам, и может быть использовано для мониторинга фиброза печени у больных хроническим гепатитом С (ХГС). Для осуществления способа в сыворотке крови определяют содержание цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12р70, ФНО-. При ИЛ-4 выше 5,6 пг/мл, ИЛ-10 выше 35 пг/мл, ФНО- выше 14 пг/мл и ИЛ-12р70 выше 8,5 пг/мл устанавливают наличие выраженного фиброза печени. Изобретение позволяет провести эффективную диагностику фиброза печени у больных хроническим гепатитом С. 3 табл.

Изобретение относится к медицине, разделу инфекционные болезни – хронические гепатиты.

На современном этапе пункционная биопсия печени (ПБП) считается «золотым стандартом» для диагностики фиброза печени у больного ХГС.ПБП с последующим морфологическим исследованием пунктата проводится для определения степени активности гепатита, стадии процесса (степени выраженности фиброза), исключения альтернативных диагнозов или выявления дополнительных патологий, а также с целью оценки эффективности противовирусной терапии [1]. Гистологическое исследование печени служит единственной возможностью точного подтверждения уже сформировавшегося, хотя и компенсированного цирроза печени, позволяет определить исходное состояние печени до лечения и прогноз ХГС и ответа на противовирусную терапию [2, 3]. К сожалению, ПБП, оставаясь «золотым стандартом» определения стадии фиброза, все-таки является методикой с определенным процентом осложнений вплоть до летальных (по данным ряда исследований количество летальных случаев варьируется от 0 до 3,3 на 1000) [4] и, по мнению некоторых авторов, обладает сомнительной информативностью для установления показаний к противовирусной терапии [3]. По их мнению, ценность биопсии ограничивается вариабельностью получаемого образца ткани печени, так как, несмотря на то, что гепатит – диффузное заболевание печени, доля фиброзной ткани в исследуемом образце может не соответствовать доли фиброзной ткани в печени в целом. Кроме этого, ПБП имеет ряд абсолютных и относительных противопоказаний. Необходимо отметить, что нередко для оценки прогноза заболевания и эффективности лечения существует необходимость повторных биопсий в течение жизни одного больного [2].

Таким образом, возможности ПБП ограничены, с одной стороны, погрешностями в получении материала и в трактовке результатов, с другой стороны – вероятностью серьезных осложнений вплоть до летальных. Кроме того, у ряда пациентов ПБП невозможно выполнить, так как имеются противопоказания (гемофилия, гемангиома, тромбоцитопения, психическая неустойчивость с фобиями и др.). Все вышеизложенное обосновывает необходимость разработки и внедрения более доступных к широкому применению и простых в использовании методов определения маркеров фиброза, в которых бы использовалась периферическая кровь.

Наиболее близкими к заявляемому изобретению для определения степени выраженности фиброза являются методы выявления в крови молекулярных соединений, участвующих в патофизиологии процесса образования внеклеточного матрикса или являющихся активаторами фиброгенеза (коллаген IV типа (CL-IV), аминотерминальный пропептид коллагена III (Р III Р), гиалуроновая кислота (ГК), металлопротеиназы (ММР) и ингибиторы металлопротеиназ (TIMP)) [6]. Данные литературы позволяют сделать заключение о том, что большинство исследователей считают серологические маркеры фиброза полезным методом мониторирования фиброза печени, методом, с помощью которого можно разграничивать стадии фиброза в печени и оценивать эффект противовирусной терапии. Однако ряд исследователей не подтверждает эти заключения [5, 7]. Кроме того, имеются расхождения в оценке диагностической значимости каждого отдельного маркера и высказываются разные мнения по вопросу о том, что собственно отражает тот или иной маркер : степень воспаления, активность фиброгенеза или уже сформировавшуюся стадию фиброза. Это расхождение отчасти можно объяснить использованием авторами разных шкал оценки фиброза и различиями в интерпретации стадии фиброза морфолагами (межисследовательские различия), возможностью «ошибки образца» печени, полученного при ПБП (достигающей 30% в такого рода исследованиях), а также особенностями применяемых тест-систем (разные производители, различные фрагменты молекул, положенные в основу тест-систем). Из-за сложности выполнения определение этих маркеров фиброза не получили широкого распространения. Все изложенное выше демонстрирует необходимость дальнейшего поиска методов диагностики фиброза печени.

В настоящее время признано, что иммунологические механизмы являются ведущими в формировании хронического гепатита. Предполагается, что повреждение печени при ХВГ обусловлено как прямыми цитопатическими эффектами вируса, так и иммуноопосредованными механизмами с возможным преобладанием тех или других на различных этапах заболевания. В стадии хронического воспаления провоспалительные цитокины стимулируют пролиферацию фибробластов и синтез коллагена как непосредственно, так и через индукцию каскада других цитокинов, которые в совокупности усиливают процессы неоангиогенеза. При длительной и неконтролируемой активации макрофагов в органном очаге хронического иммунного воспаления сочетанный эффект медленнодействующих цитокинов и ростовых факторов приводит к замещению функционально полноценных тканей фиброзной тканью. Выступая в качестве первой линии защиты организма от вирусного патогена, мононуклеарные фагоциты сами становятся мишенями атаки вируса, что приводит к нарушению их функций. Следовательно, возбудитель фактически может ускользать от эффекторных механизмов иммунитета, сохраняя вирулентность, что объясняет прогрессирующее хроническое поражение клеток печеночной паренхимы с исходом либо в цирроз либо в рак печени.

Таким образом, цитокины, как продуцируемые локально в печени, так и циркулирующие в системном кровотоке, играют важную роль в контролировании вирусной репликации и вносят существенный вклад в гепатоцеллюлярное повреждение.

Задача изобретения – разработка эффективного способа диагностики фиброза печени при ХГС с использованием показателей цитокинов сыворотки крови.

Заявляемый способ диагностики фиброза печени с использованием сывороточных цитокинов имеет следующие общие признаки с его аналогом (прототипом) определения в крови серологических маркеров фиброза:

1. Методика забора исследуемого материала (кровь из локтевой вены не более 5 мл однократно).

2. Позволяет определить присутствие некровоспалительных повреждений ткани печени.

Отличительными от прототипа признаками заявляемого способа являются:

1. Определение содержания цитокинов крови – ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12р70 и ФНО-.

2. Прямая взаимосвязь сывороточных цитокинов с локальными показателям изучаемых параметров непосредственно в органе-мишене.

3. Отражает сформировавшуюся стадию фиброза.

При проведении анализа имеющейся научной и патентной информации не обнаружено сведений, относящихся к использованию определения содержания сывороточных цитокинов с учетом их корреляции с показателями локального уровня, для диагностики фиброза печени при ХГС.

Объектом исследования были 40 пациентов с ХГС. Анализировали содержание 8 цитокинов – ИЛ-1 а, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12р40, ИЛ-12р70, ФНО-, ИФН- в сыворотке крови и супернатанте биоптата печени пациентов ХГС и здоровых доноров (5 человек). Для этого периферическую кровь (5 мл) забирали шприцем из локтевой вены, центрифугировали при 3000 об/мин на холоде в течение 10 мин. Сыворотку разливали по 0,5 мл в эпиндорфы, замораживали и хранили до использования при -76°С. Всем пациентам выполнялась чрескожная пункционная биопсия печени иглой Менгини с получением столбика биоптата не менее 20 мм, от которого 2-3 мм субстрата гомогенезировали с добавлением физиологического раствора (5 мл), ресуспендировали и центрифугировали при 5000 об/мин на холоде в течение 10 мин. Полученный супернатант распределяли по 0,5 мл в эпиндорфы, замораживали и хранили до использования при -76°С. Применяли метод твердофазного ИФА с использованием диагностических наборов (R&D Diagnostics Inc., USA) с чувствительностью 1 пг/мл. Расчеты количества цитокинов проводили путем построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы и выражали в пг/мл. В качестве контроля при исследовании уровней цитокинов в гомогенизатах печеночных биоптатов использовались образцы печеночной ткани 5 доноров, не имеющих хронических заболеваний и маркеров инфицирования вирусами парентеральных гепатитов. Учитывая небольшие пределы разбросов показателей, мы сочли возможным ограничиться этим количеством исследований. Необходимо принять во внимание также сложность и специфику забора материала. Оценку результатов проводили с использованием статистических приемов для малых выборок. Для морфологического исследования биоптаты обрабатывали по общепринятым методикам и заключали в парафин. В гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону, определяли активность некровоспалительных изменений на основе полуколичественной оценки по R.G. Knodell et al. (1981) в модификации В.В. Серова (1996) и индекс фиброза по V.J.Desmet et al. (1994) по алгоритму METAVIR. Для оценки информативности системного и локального статуса цитокинов провели корреляционный анализ взаимосвязей между морфологическими характеристиками ХГС и их концентрацией в сыворотке крови и супернатантах биоптатов печени. Статистическая обработка полученных материалов произведена с применением прикладных программ BIOSTAT. С целью определения достоверности различий использован t-критерий Стьюдента для факторов, имеющих нормальное распределение. Корреляционный анализ проводили с использованием непараметрической корреляции Спирмена.

При изучении содержания цитокинов в сыворотке крови при ХГС наблюдалось достоверное увеличение концентраций цитокинов Тh2-типа (ИЛ-4, ИЛ-10) и провоспалительных цитокинов ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-12р40, ИЛ-12р70 на фоне достоверного снижения уровней Тh1 цитокинов (ИЛ-2 и ИФН-). При этом имеется статистически значимое отличие показателей содержания уровней цитокинов в группах пациентов с разными стадиями фиброза (табл.1). Из таблицы видно, что количество провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ФНО-) в сыворотке крови более чем в 2,5 раза превышают их уровни у здоровых людей. При этом содержание ИЛ-1 и ФНО- у больных с F2 и F3 достоверно выше их уровня в группе больных без признаков фиброза (F0). При этом не определено достоверных различий между концентрацией исследуемых цитокинов в группах с F0 и начальными его проявлениями (F1) (р>0,05). Уровни сывороточных цитокинов ИЛ-2 и ИНФ-, продуцируемых Т-клетками 1 типа, значительно снижены, в особенности ИФН-. При сравнении содержания исследуемых цитокинов у больных с разными стадиями фиброза отмечено, что статистически значимые различия определялись в группе больных с F3 (р<0,01). В то время как в группе с F0 показания уровней сывороточных ИЛ-2 и ИФН- по сравнению со здоровыми не отличались (0,17±0,09 пг/мл и 10,0±4,8 пг/мл против 0,2±0,03 пг/мл 14,3±1,7 пг/мл соответственно, р<0,05). Что касается сывороточного содержания цитокинового профиля Т-клеток 2 типа, то для ИЛ-4 и ИЛ-10 обнаружены значительные повышения их уровней по мере прогрессирования фиброза. Концентрация ИЛ-4 в группе без фиброза статистически значимо не отличалась от показателя уровня исследуемого цитокина в сыворотке крови у здоровых (4,5±1,0 пг/мл против 3,2±1,2 мг/мл, р>0,05). Содержание сывороточного ИЛ-10 в группах больных с F0 и F1 также достоверно не изменялось (28,5±7,8 пг/мл и 34,4±8,1 пг/мл соответственно, р>0,05). Исследование локального содержания ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12р40, ИЛ-12р70, ФНО- свидетельствует о достоверном увеличении их уровней, a также о снижении концентраций ИЛ-2, ИФН- по сравнению с группой контроля (табл.2). Самый низкий локальный уровень провоспалительных и Тh1-продуцируемых цитокинов наблюдался при F1 для ИФН- (р<0,01) и при F2 для ИЛ-2 (р<0,05). Содержание ИЛ-1 в супернатанте печени достоверно не отличалось между показателями в группах с F2 и F3 (75,0±10,8 пг/мл и 100,0±21,5 пг/мл соответственно, р>0,05). Локальный уровень ФНО- в исследуемых группах имел достоверную тенденцию к увеличению его концентрации при прогрессировании фиброза и в отличие от сывороточного уровня был достоверно отличен в группах с F0 и F1 (10,1±1,5 пг/мл и 59,0±2,8 пг/мл соответственно, р<0,01). Содержание цитокинов профиля Th 2 типа на местном уровне характеризовалось статистически значимым увеличением концентрации ИЛ-4 и ИЛ-10 в исследуемых группах. В отличие от сывороточных значений этих цитокинов наблюдалось значительное их увеличение (на местном уровне) по сравнению с группой здоровых более чем в 20 раз в группе с F3 (для ИЛ-4, р<0,001). Содержание ИЛ-12р40 на системном уровне в исследуемых группах достоверно отличалось от группы здоровых (р<0,05), однако в группах с разной стадией фиброза статистическая значимость различий была неравномерной. В отличие от этого на местном уровне четко определялась статистическая значимость различий в содержании исследуемого цитокина в группах с разными стадиями фиброза (р<0,001). При этом в группе с высокой стадией фиброза (F3) концентрация локального ИЛ-12р40 превосходила нормальные значения в 300 раз, что отличалось от сывороточного показателя (в 5 раз). Таким образом, несмотря на определенные различия, изменение баланса цитокинов Th1 и Th2 на локальном и системном уровнях носит однонаправленный характер. При изучении корреляционных взаимосвязей между исследуемыми цитокинами в различных биологических субстратах (сыворотке крови и супернатантах печени) и выраженностью фиброза печени в баллах выявлена высокая степень корреляции между параметрами ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12р70 и ФНО-, что дает возможность использования их в качестве достоверных маркеров выраженности фиброза печени (табл.3). Наиболее значимыми для оценки выраженности фиброза явилось повышение уровней сывороточных ИЛ-4 (>5,6 пг/мл), ИЛ-10 (>35 пг/мл), ФНО- (>14 пг/мл) и ИЛ-12р70 (>8,5 пг/мл). Следовательно, определенные интервалы параметров иммунитета могут служить критериями неблагоприятного течения болезни. Согласно литературным данным, высокий уровень ФНО- связывают с индукцией апоптоза гепатоцитов и макрофагов, что стимулирует экспрессию интегрина Мас-1, который в свою очередь манифестирует переход воспалительного процесса в цирроз и ограничивает выработку цитокинов Тh1-типа ответа [5]. Именно этим можно объяснить высокую степень корреляционных связей между концентрацией ФНО-, продуцируемого преимущественно клетками СММ, и ИЛ-4, ИЛ-10 – продуцируемых Th2 типа, на системном и локальном уровнях и выраженностью фиброза, что возможно ведет к избыточной активации гуморальной составляющей иммунной системы с иммунопатологическими последствиями. Преобладание увеличения концентрации локальных цитокинов может быть связано и с нарушением их инактивации поврежденной печенью. К противовоспалительным механизмам относится локальное и системное действие ИЛ-10, направленное на ингибирование продукции ФНО- и регуляцию синтеза ИЛ-12. Однако при дисбалансе провоспалительных и противовоспалительных цитокинов иммунологические механизмы приобретают патологический характер, что имеет место при ХГС.

Таким образом, установленные связи между содержанием исследуемых цитокинов на системном и локальном уровне с морфологическими показателями свидетельствуют о том, что из всех изученных в работе иммунологических тестов наибольшей значимостью для определения стадии фиброза являлись показатели содержания как в сыворотке, так и в супернатантах биоптатов печени ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12р70 и ФНО-. Следовательно, использование определения концентраций указанных цитокинов в сыворотке крови является альтернативным методом скрининга фиброза печени.

Литература:

2. Майер К.П. Гепатит и последствия гепатита. Практическое руководство. – М.: ГЭОТАР, Медицина, 1999. – 432 с.

Таблица 1
Содержание цитокинов (в пг/мл) в сыворотке крови у больных ХГС с различной стадией фиброза
Группы обследованных	ИЛ-1	ИЛ-2	ИЛ-4	ИЛ-10	ИЛ-12р40	ИЛ-12р70	ФНО-	ИФН-
F0	1,2±0,2*	0,17±0,09	4,5±1,0	28,5±7,8*	69,5±11,2	85,8±11,1*	9,1±2,5*	10,0±4,8
(n=12)	Р2>0,05	Р2>0,05	Р2<0,05	Р2>0,05	Р2>0,05	Р2<0,05	Р2>0,05	P2>0,05
	Р3<0,05	Р3>0,05	Р3<0,01	Р3<0,01	Р3<0,01	Р3<0,01	Р3<0,01	Р3>0,01
	Р4<0,001	Р4>0,05	Р4<0,01	Р4<0,01	Р4<0,001	Р4<0,01	Р4<0,01	Р4<0,01
F1	1,5±0,4*	0,15±0,05	11,5±2,1*	34,4±8,1*	100,8±17,0*	62,5±9,4*	13±1,8*	8,1±2,5*
(n=13)	P1>0,05	P1>0,05	P1<0,05	P1>0,05	P1>0,05	P1<0,05	P1>0,05	P1>0,05
	Р3<0,01	Р3>0,01	Р3<0,05	Р3<0,05	Р3<0,01	Р3<0,01	Р3<0,01	Р3>0,01
	Р4<0,01	Р4<0,05	Р4<0,01	Р4<0,01	Р4<0,01	Р4<0,01	Р4<0,01	Р4<0,01
F2	5,0±0,9*	0,16±0,03*	17,0±1,1*	70,1±15,1*	180±30,5*	30,5±2,3*	20±1,9*	5,4±1,8*
(n=8)	P1<0,01	P1>0,01	P1<0,01	P1<0,01	P1<0,01	P1<0,01	Pi<0,01	P1>0,01
	Р2<0,01	Р2>0,01	Р2<0,05	Р2<0,05	Р2<0,01	Р2<0,01	Р2<0,01	Р2>0,01
	Р4<0,05	Р4<0,05	Р4<0,05	P4<0,05	Р4>0,05	Р4<0,05	Р4<0,01	Р4<0,01
F3	7,7±1,3*	0,1±0,02*	20,1±1,2*	107,5±10,9*	250±70,0*	10,9±1,2*	28,5±3,5*	1,2±0,4*
(n=7)	P1<0,01	P1<0,05	P1<0,01	P1<0,001	P1<0,01	P1<0,01	P1<0,01	P1<0,01
	Р2<0,01	Р2<0,05	Р2<0,01	Р2<0,01	Р2<0,01	Р2<0,01	Р2<0,01	Р2<0,01
	Р3<0,05	Р3<0,01	Р3<0,05	Р3<0,01	Р3>0,05	Р3<0,05	Р3<0,01	Р3<0,01
контроль (n=5)	0,53±0,1	0,2±0,03	3,2±1,2	13,9±0,7	54,8±3,7	6,3±1,2	4,3±1,2	14,3±1,7
Достоверность различий изучаемого показателя по сравнению с:
* – контрольной группой (Р<0,05)
P1 – группой с F0
Р2 – группой c F1
Р3 – группой с F2
P4 – группой с F3

Таблица 2
Содержание цитокинов (в пг/мл) в супернатанте печени у больных ХГС с различной стадией фиброза
Группы обследованных	ИЛ-1	ИЛ-2	ИЛ-4	ИЛ-10	ИЛ-12р40	ИЛ-12р70	ФНО-	ИФН-
F0	20,0±3,5	30,1±3,1	75,1±20,0	150,1±30,1	20,5±3,5*	30,3±5,1*	10,1±1,5*	70,5±12,5
(n=12)	Р2<0,01	Р2>0,01	Р2<0,001	Р2>0,05	Р2<0,01	Р2<0,01	Р2<0,01	Р2<0,05
	Р3<0,01	Р3<0,01	Р3<0,001	Р3<0,01	Р3<0,01	Р3<0,01	Р3<0,01	Р3<0,05
	Р4<0,01	Р4<0,01	Р4<0,001	Р4<0,01	Р4<0,001	Р4<0,01	Р4<0,001	Р4<0,01
F1	70,0±11,2*	20,5±5,1	200±95,1*	170±18,5*	50,1±7,8*	20,5±1,2*	59±2,8*	30,1±9,5*
(n=13)	P1<0,01	P1<0,001	P1<0,01	P1>0,05	P1<0,01	P1<0,01	P1<0,01	P1<0,05
	Р3>0,05	Р3<0,001	Р3<0,05	Р3<0,05	Р3<0,01	Р3<0,05	Р3<0,01	Р3>0,05
	Р4<0,01	Р4<0,001	Р4<0,01	Р4<0,01	Р4<0,001	Р4<0,01	Р4<0,001	Р4>0,05
F2	75±10,8*	10,5±1,5*	400±90,3*	240±70,8*	200,1±90,1*	10,2±2,4*	100±15,9*	30,8±8,1*
(n=8)	P1<0,01	P1<0,01	P1<0,01	P1<0,01	P1<0,01	P1<0,01	P1<0,01	P1<0,05
	Р2>0,05	Р2<0,01	Р2<0,05	Р2<0,05	Р2<0,01	Р2<0,01	Р2<0,01	Р2>0,05
	Р4<0,05	Р4>0,05	Р4<0,01	Р4<0,01	Р4<0,001	Р4<0,01	Р4<0,01	P4>0,05
F3	100±21,5*	8,3±1,1*	800±100,0*	450,5±80,0*	2000±180*	2,1±0,9*	200±20,8*	25,3±7.5*
(n-7)	P1<0,01	P1<0,001	P1<0,001	P1<0,01	P1<0,001	P1<0,01	P1<0,001	P1<0,01
	Р2<0,01	P2<0,01	Р2<0,01	Р2<0,01	Р2<0,001	Р2<0,01	Р2<0,001	Р2>0,05
	Р3>0,05	Р3>0,05	Р3<0,001	Р3<0,01	Р3<0,001	Р3<0,01	Р3<0,01	Р3>0,05
контроль	16,4±2,9	29,0±2,8	55,0±9,4	139,4±13,2	6,8±0,9	3,3±0,7	4,9±1,4	64,4±2,9
(n=5)
Достоверность различий изучаемого показателя по сравнению с:
* – контрольной группой (Р<0,05)
P1 – группой с F0
Р2 – группой с F1
Р3 – группой с F2
Р4 – группой с F3

Таблица 3
Коэффициенты корреляции (R) и уровни их значимости (р) между выраженностью фиброза (F) и показателями содержания сывороточных и локальных цитокинов при ХГС
Цитокины	Сыворотка						Супернатант печени
	F1(l-4)		F2(5-8)		F3(9-12)		F1(1-4)		F2(5-8)		F3(9-12)
	(n=15)		(n=10)		(n-5)		(n=15)		(n=10)		(n=5)
	R	Р	R	Р	R	Р	R	Р	R	р	R	Р
ИЛ-1	0,1	0,8	0,09	0,7	0,65	0,01	0,14	0,7	0,33	0,2	0,68	0,001
ИЛ-2	0,26	0,4	0,33	0,2	0,49	0,1	0,28	0,4	0,22	0,4	0.95	0,001
ИЛ-4	0,97	0,001	0,87	0,001	0,98	0,001	0,95	0,01	0,89	0,001	0,97	0,001
ИЛ-10	0,96	0,001	0,93	0,001	0,94	0,001	0,91	0,01	0,92	0,001	0,94	0,01
ИЛ-12р40	0,1	0,8	0,99	0,001	0,97	0,001	0,18	0,6	0,9	0,7	0,93	0,001
ИЛ-12р70	0,94	0,01	0,93	0.001	0,98	0,001	0,94	0,01	0,99	0,01	0,98	0,001
ФНО-	0,87	0,001	0,9	0,001	0,98	0,01	0,93	0,01	0,9	0,01	0,98	0,001
ИФН-	0,76	0,001	0,67	0,01	0,48	0,1	0,17	0,6	0,3	0,2	0,96	0,001
Выделенные цифры означают максимальную степень R и p между изучаемыми показателями

Формула изобретения

Способ мониторинга фиброза печени у больных хроническим гепатитом С, включающий проведение исследований сыворотки крови, отличающийся тем, что определяют содержание сывороточных цитокинов – ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12р70 и ФНО- и при повышении уровней ИЛ-4 выше 5,6 пг/мл, ИЛ-10 выше 35 пг/мл, ФНО- выше 14 пг/мл и ИЛ-12р70 выше 8,5 пг/мл устанавливают наличие выраженного фиброза печени.