Патент на изобретение №2308940

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ, ОБЛАДАЮЩИХ ИММУНОКОРРИГИРУЮЩИМ И ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано при производстве лекарственных средств, корригирующих иммунную и гепатобиллиарную системы организма. Изобретение раскрывает способ получения липосом, обладающих иммунокорригирующим и гепатопротекторным действием, заключающийся в том, что проводят экстракцию фосфолипидов из печени байкальской нерпы, растворяют смесь полученных фосфолипидов и жир байкальской нерпы в органическом растворителе в соотношении 4:6 с антиоксидантом -токоферолом, высушивают тонкий слой липидов на роторном испарителе, добавляют буферный раствор, встряхивают смесь до получения однородной суспензии, проводят обработку липидной смеси ультразвуком при водяном охлаждении, далее центрифугируют смесь и отделяют верхние три четверти надосадочной жидкости. Заявляемый способ позволяет получить липосомальное средство, обладающее самостоятельным лечебным – иммунокорригирующим и гепатопротекторным – действием, и расширить сырьевую базу для получения липосом, используя дешевое природное сырье. 6 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано при производстве лекарственных средств, корригирующих иммунную и гепатобилиарную системы организма.

Однако в известном способе не выявлено влияние полученных липосом на иммунную и гепатобилиарную системы организма.

Известен способ получения липосом, изготавливаемых из лецитинов растительного и животного происхождений и смеси кислых (соевых) фосфолипидов, пригодных для инкапсулирования лекарств (цитостатиков, иммуномодуляторов, полиненасыщенных жирных кислот из морских животных, обладающих кардиопротекторными, антиоксидантными и гепатопротекторными свойствами) [Способ получения липосом. Патент РФ 02071765, опубл. 20.01.1997 г.].

Однако недостатком известного способа является то, что полученные средства используются только в качестве носителей лекарственных препаратов и биологически активных веществ, не обладают каким-либо самостоятельным биологически активным действием и применяются только для парентерального введения в организм, в то время как не была изучена их активность при пероральном введении.

Известен способ получения липосом, содержащих биологически активные вещества (негормональные противовоспалительные средства и др.), а также противовирусные и противогрибковые агенты [см. Liposomes containing biologically active compounds. EP 1515698 A2 N03761255. 23.03.2005].

Однако недостатком известного способа является то, что полученные липосомальные средства обладают только анальгетическими, противовоспалительными, противобактериальными и противовирусными свойствами, тогда как не было выявлено их иммунобиологическая и гепатопротекторная активность.

Известен способ получения липосом из яичных фосфолипидов, включающий экстракцию суммарных фосфолипидов из яичных желтков, растворение яичных фосфолипидов в органическом растворителе, высушивание тонкого слоя яичных фосфолипидов в круглодонной колбе на роторном испарителе, добавление буферного раствора, встряхивание смеси, обработку смеси ультразвуком, центрифугирование смеси и отделение верхних трех четвертей надосадочной жидкости [см. Биологические мембраны. Методы: Пер. с англ. /Под ред. Дж.Б.Финдлея, У.Г.Эванза. – М.: Мир, 1990, с.188-195].

Недостатком данного способа является то, что полученные липосомы используются только в качестве носителей лекарственных препаратов и не обладают каким-либо самостоятельным фармакологическим воздействием.

Известен способ получения липосом из яичных фосфолипидов, включающий экстракцию суммарных фосфолипидов из яичных желтков, растворение смеси яичных фосфолипидов и жира байкальской нерпы в соотношении 4:6 в органическом растворителе, высушивание тонкого слоя яичных фосфолипидов в круглодонной колбе на роторном испарителе, добавление раствора, содержащего 0.25 М сахарозу, 0.01 М трис-буфер, 0.001 М ЭДТА, рН 7.4, встряхивание смеси до получения однородной суспензии на механической качалке в течение 30 минут, обработку смеси в течение 7 минут ультразвуком на диспергаторе УЗДН-2Т при водяном охлаждении при частоте 22 кГц, центрифугирование смеси в течение 90 минут при 105000 g и отделение верхних трех четвертей надосадочной жидкости [см. Способ получения липосом. Патент РФ №2153328, опубл. 27.07.2000 г., Бюл. №21].

Полученные по известному способу липосомы обладают иммунокорригирующими свойствами, тогда как не выявлено их влияние на гепатобилиарную систему организма.

Задача, решаемая в предлагаемом изобретении, заключается в изменении фармакологических свойств липосом.

Технический результат, достигаемый при осуществлении заявляемого способа, – это создание липосомального средства, обладающего гепатопротекторными свойствами с высокими иммунокорригирующими свойствами.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что известный способ характеризуется тем, что проводят экстракцию фосфолипидов из печени байкальской нерпы, растворяют смесь полученных фосфолипидов и жир байкальской нерпы в органическом растворителе в соотношении 4:6 с антиоксидантом -токоферолом, высушивают тонкий слой липидов на роторном испарителе, добавляют буферный раствор, встряхивают смесь до получения однородной суспензии, проводят обработку липидной смеси ультразвуком при водяном охлаждении, далее центрифугируют смесь и отделяют верхние три четверти надосадочной жидкости.

Байкальская нерпа – эндемик уникального озера Байкал, относится к отряду ластоногих семейства настоящих тюленей. В данное время нерпа – важнейший объект зверобойного промысла, добывается с единственной целью получения меха животного, а жир и другие виды тканей (в том числе и печень), в лучшем случае направляются на зверофермы для откорма животных либо на техническую переработку [В.Д.Пастухов Нерпа Байкала. – Новосиб.: ВО Наука. 1993, 271 с.].

Как известно, основную массу покровных жиров морских млекопитающих составляют простые липиды – триацилглицериды. Исследования химического состава жира выявили 60 жирных кислот, содержащих от 8 до 22 углеродных атомов. Из них на долю насыщенных кислот приходится 17-19%, мононенасыщенных 59-60%, полиненасыщенных 22-23% (в том числе диеновых 6.1-7.0%, триеновых 0.2-0.3%, тетраеновых 3.9-4.1%, пентаеновых 4.6-5.0%, гексаеновых 6.2-7.0%). Высокая биологическая ценность жира нерпы обусловлена в основном содержанием таких высоконенасыщенных кислот, как экозапентаеновой (2.65%) и докозагексаеновой (6.28%). Эти кислоты являются предшественниками особых гормоноподобных веществ – простагландинов и тромбоксанов. В результате исследований фракционного состава жира нерпы было показано, что доминирующей фракцией являются триацилглицериды (до 99%). Свободные жирные кислоты, эфиры стеаринов находятся в следовых количествах (до 0.2%). Количество неомыляемых соединений не превышает 0.3%, остальные 0.5% приходятся на сумму ди- и моноглицеринов. Витамины А, Д, К в жире нерпы не обнаружены. Токоферолы содержатся в следовых количествах.

Жирнокислотный состав липидов печени байкальской нерпы включает в себя более 25-и полиненасыщенных жирных кислот с длиной цепи более 14-и углеродных атомов, наиболее распространенными из которых являются олеиновая – 18:1n-9 (11.62%), линолевая – 18:2n-6 (4.31%), эйкозадиеновая – 20:2n-6 (1.55%), дихомо-гамма-линоленовая – 20:3n-6 (1.12%), арахидоновая – 20:4n-6 (20.15%), эйкозапентаеновая – 20:5n-3 (0.44%), докозагексаеновая – 22:6n-3 (6.73%). Анализ жирнокислотного состава липидов печени нерпы показал, что содержание насыщенных, мононенасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот практически одинаково и составляет 31.85%, 33.15% и 35.70% соответственно. При этом соотношение жирных кислот семейств омега-6/омега-3 составляет 3.19:1, что позволяет отнести печень байкальской нерпы к числу перспективных источников сырья для использования в пищу и использования в качестве БАВ.

Преимуществом жира, содержащегося во внутренних органах, перед покровным, является наличие в нем фосфолипидов. Как показали исследования, содержание фосфолипидов в печени нерпы составило 4.7% от сухого остатка. Среди фосфолипидов в печени байкальской нерпы преобладают по количеству фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин (41.07% и 37.22% по отношению к общему количеству фосфолипидов соответственно) [Кабирова И.Р. Характеристика и промышленное использование печени байкальской нерпы на пищевые цели. Дисс…к.т.н. – Улан-Удэ, 2005. – 107 с.].

Соотношение фосфолипидов печени нерпы и жира нерпы подбирали таким образом, чтобы обеспечить максимальное иммунокорригирующее действие.

Иммунокорригирующую активность изучали в реакциях, ответственных за клеточный (в реакциях «трансплантат против хозяина» – РТПХ и гиперчувствительность замедленного типа – ГЗТ) и гуморальный иммунитет (в реакции антителообразования).

Эксперименты проводились на мышах обоего пола линии F1 (СВАхС57В1/6), а также линии СВА массой 20-22 г. В работе были исследованы: 1) липосомы, приготовленные на основе яичных фосфолипидов с добавлением жира нерпы в соотношении 4:6; 2) липосомы, приготовленные на основе фосфолипидов печени нерпы с добавлением жира нерпы в соотношениях 4:6 и 6:4; 3) липосомы, приготовленные на основе фосфолипидов печени нерпы. Препараты вводились экспериментальным животным ежедневно перорально в течение 14 дней в объеме 0.2 мл. Действие экстракта было изучено на животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии, которое вызывали введением азатиоприна в концентрации 50 мг/кг, что вызывало угнетение показателей клеточного и гуморального иммунитета.

Использование липосом, содержащих разные соотношения фосфолипидов печени нерпы и жира нерпы, на фоне иммунной супрессии восстанавливало показатель РТПХ лабораторных животных до уровня интактных. Несколько больший (на 5-10%) по сравнению с остальными группами индекс реакции был отмечен в группе животных, получавших липосомы, содержащие фосфолипиды печени и жир нерпы в соотношении 4:6 (см. табл. 1).

Использование всех исследуемых липосомальных средств восстанавливало показатель клеточноопосредованной реакции ГЗТ лабораторных животных, находившихся в состоянии иммунной супрессии, до уровня показателя ГЗТ у интактных животных, причем максимальное значение индекса достигало в группе, получавшей липосомы, полученные на основе фосфолипидов печени нерпы с добавлением жира в соотношении 4:6 (см. табл.2).

Как показали результаты исследования, липосомы на основе фосфолипидов печени с добавлением жира нерпы, взятых во всех изучаемых соотношениях, проявляли большую активность по сравнению с липосомами на основе яичных фосфолипидов и липосомами на основе только фосфолипидов печени нерпы на фоне иммунодепрессии и вызывали достоверное увеличение количества АОК как в абсолютных значениях, так и при расчете на 10⁶ спленоцитов; при этом показатели антителообразующей активности клеток селезенки подопытных животных восстанавливались до уровня интактных животных (см. табл.3).

Полученные данные свидетельствуют о том, что оптимальным соотношением: фосфолипиды печени нерпы: жир нерпы, при котором наблюдалось максимальное иммуностимулирующее действие, является 4:6.

Согласно этим данным можно сделать вывод о стимулирующем действии полученных липосом на фагоцитарную активность макрофагов in vitro.

Гепатопротекторную активность липосом, полученных предложенным способом, изучали на крысах-самцах линии Wistar с исходной массой 180-200 г. Липосомальные средства на основе фосфолипидов печени нерпы вводили перорально в объеме 0.5 мл/200 г массы крысы 1 раз в сутки в течение 7-и, 14-и и 21-го дня. Соответствующие контрольные группы животных в аналогичных условиях получали дистиллированную воду в эквивалентном объеме. Действие липосомальных средств на основе фосфолипидов печени нерпы было изучено на животных с токсическим гепатитом. Токсический гепатит вызывали подкожным введением крысам 50%-ного масляного (V/V) раствора тетрахлорметана (CCl₄) в объеме 0,4 мл на 100 г веса, 1 раз в сутки, в течение четырех дней. В качестве препарата сравнения был использован «Холосас», рекомендуемый при заболеваниях гепатобилиарной системы в качестве желчегонного средства [Машковский М.Д. Лекарственные средства. – 15-е изд., перераб., испр. и доп. – М.: ООО «Изд-во Новая волна», 2005. – 1200 с.]. «Холосас» вводили крысам с CCl₄ -гепатитом в объеме 0,1 мл на 100 г массы. Желчь для исследования получали в условиях острых опытов под наркозом (0,1 мл внутрибрюшинно 25% водного раствора тиопентала-натрия).

В процессе экспериментальной фармакотерапии токсического гепатита липосомами, приготовленными заявляемым способом, наблюдали ускорение желчевыделительной функции печени крыс (табл.5). На ранних сроках эксперимента (7-й день) у крыс, получавших липосомы, скорость секреции желчи возрастала по сравнению с животными контрольной группы на 20.4%, 35%, 29% и в 2 раза в 1-й, 2-й, 3-й и 4-й часы наблюдения соответственно. На 14-й день опыта под влиянием липосом скорость секреции желчи возрастала в 1.6 раза (после 1-го, 2-го и 4-го часа опыта) и в 1.8 раза (после 3-го часа опыта) по сравнению с контролем. На 21-й день опыта у крыс, получавших испытуемые липосомы, скорость секреции желчи возрастала умеренно. Так, через 1 час после их введения скорость секреции желчи увеличилась на 33%, а через 2 часа – на 27% по сравнению с контролем; тогда как через 3 и 4 часа после введения липосом существенной разницы в скорости выделения желчи у животных не наблюдалось. Необходимо отметить, что в некоторые сроки эксперимента скорость выделения желчи у животных, принимавших липосомы, была достоверно выше таковой у животных, получавших фармакопейное средство «Холосас».

Биохимические показатели секретируемой желчи подопытных животных представлены в табл. 6, из которой следует, что при введении животным липосом общее количество желчи, выделенное за 4 часа (весь период наблюдения), повышалось на 8.3% (после 7-и суток), на 68.7% (после 14-и суток) и на 20.3% (после 21-х суток) по сравнению с контролем в соответствующие сроки эксперимента. Необходимо отметить, что по данному показателю активность липосом была достоверно выше, чем у «Холосаса». Наряду с ускорением холереза под влиянием липосом отмечены позитивные изменения и в химическом составе желчи. Так, концентрация общих желчных кислот в секретируемой желчи повышалась с 7-х суток наблюдения и превышала таковую в контроле на 58% (так же как и на 14-е сутки), а на 21-е сутки – на 72%; содержание билирубина повышалось на 20% (на 7-е и 14-е сутки) и на 85% (на 21-е сутки эксперимента). При этом количество холестерина оставалось на одном и том же уровне на 7-е сутки, на 14-е сутки уменьшалось на 18%, а на 21-е сутки увеличивалось в 4 раза (см. табл.6).

По результатам исследований активности липосомального средства, полученного предложенным способом, видно, что оно является корректором иммунной и гепатобилиарной систем организма. Это в свою очередь позволяет предполагать эффективность применения полученного средства при состояниях, сопровождающихся угнетением иммунной системы организма и нарушениями желчеотделительной функции печени.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, позволил установить, что заявитель не обнаружил аналогичных технических решений.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условиям «новизна» и «изобретательский уровень».

Заявляемый способ получения липосом осуществляется следующим образом.

Фосфолипиды по известному способу экстрагируют из печени байкальской нерпы [см. М. Кейтс. Техника липидологии. М.: «Мир», 1975. – 236 с.]. К 6-7 г свежей печени прибавляют 3 мл воды и 30 мл смеси хлороформ-метанол (1:2) и ткань гомогенизируют в гомогенизаторе с ножами [Foss Tecato-2094] в течение 2 мин при комнатной температуре. Гомогенат центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин, супернатант декантируют и остаток реэкстрагируют 38 мл смеси хлороформ-метанол-вода (1:2:0.8) в гомогенизаторе [Foss Tecato-2094] в течение 2 мин. Ткань отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин, объединенные супернатанты разбавляют 20 мл хлороформа и 20 мл воды, водно-метанольную и хлороформную фазу разделяют отстаиванием в делительной воронке. Нижний хлороформный слой концентрируют на роторном испарителе [испаритель ротационный ИР-1М2 ТУ 25-1173.102-84] при 30-35°С. Остаток растворяют в 10 мл хлороформа. Далее к раствору суммарных липидов в хлороформе приливают пятикратный объем ацетона и смесь выдерживают 2-3 ч при 0°С, выпавший осадок отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин. С помощью пипетки вносят раствор фосфолипидов печени нерпы, жира байкальской нерпы [ТУ 9281-017-02069473-2001] и антиоксиданта альфа-токоферола [см. М.Д.Машковский. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т.2. – 11-е изд. Стер. – М.: Медицина, 1988. – С.37-39] в соотношении 4:6:0.05 (0.1 г смеси) в органическом растворителе (1 мл хлороформа + 1 мл метанола) в толстостенную круглодонную колбу. Испаряют растворитель на роторном испарителе [испаритель ротационный ИР-1М2 ТУ 25-1173.102-84] так, чтобы дать возможность полученной смеси распределиться в виде тонкой пленки по стенке колбы. В колбу добавляют раствор, содержащий 0.25 М сахарозу, 0.01 М трис-буфер; 0.001 М ЭДТА, рН 7.4, встряхивают до получения однородной суспензии на механической качалке [Установка выращивания микроорганизмов, термостатированная УВМТ-12-250] в течение 30 минут. Обрабатывают липидную смесь в течение 7 минут ультразвуком на диспергаторе УЗДН-2Т при водяном охлаждении при частоте 22 кГц. Обработанную смесь центрифугируют в течение 90 минут при 105000 g и отбирают верхние три четверти надосадочной жидкости.

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о том, что заявляемый способ позволяет получить липосомальное средство, обладающее самостоятельным лечебным – иммунокорригирующим и гепатопротекторным – действием, и расширить сырьевую базу для получения липосом, используя дешевое природное сырье.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «промышленная применимость».

Формула изобретения

Способ получения липосом, обладающих иммунокорригирующим и гепатопротекторным действием, характеризующийся тем, что проводят экстракцию фосфолипидов из печени байкальской нерпы, растворяют смесь полученных фосфолипидов и жир байкальской нерпы в органическом растворителе в соотношении 4:6 с антиоксидантом -токоферолом, высушивают тонкий слой липидов на роторном испарителе, добавляют буферный раствор, встряхивают смесь до получения однородной суспензии, проводят обработку липидной смеси ультразвуком при водяном охлаждении, далее центрифугируют смесь и отделяют верхние три четверти надосадочной жидкости.