Патент на изобретение №2308280
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ КЛОНИРОВАНИЯ IN VITRO РЕГИОНАРНЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ СЕРДЦА
(57) Реферат:
Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицине и касается способа клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца. Способ осуществляется с помощью механической и ферментативной обработки сердечной мышцы лабораторных животных, полученные клеточные элементы помещают в культуральную среду следующего состава: 90% среды DMEM, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина, 25 мг/л инсулина, 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 10 нг/мл интерлейкина-6, 25 нг/мл фактора роста фибробластов, 10 нг/мл эндотелиального фактора роста-
Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицине и касается способа клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца. Известно большое количество способов культивирования in vitro клеточных элементов многих тканей в культуральных средах различного состава, с различными добавками, при этом чаще всего используют инкубацию клеточного материала в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха [1, 2]. Однако недостатком существующих способов является то, что их использование не дает возможности клонировать in vitro региональные клетки-предшественники, находящиеся в сердечной мышце взрослого организма. Разработка данного способа является актуальной задачей, решение которой необходимо для проведения фундаментальных исследований по изучению пролиферативно-дифференцировочного баланса регионарных сердечных стволовых клеток in situ и закономерностей их функционирования и жизнедеятельности, а также для изучения влияния на данные элементы имеющихся в лечебной практике препаратов и создания новых средств, стимулирующих данную фракцию резидентных клоногенных клеточных элементов сердца с целью повышения эффективности терапии сердечных заболеваний. Задачей, решаемой данным изобретением, является создание способа клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца взрослого организма. Поставленная задача достигается тем, что клеточные элементы диссоциированной с помощью механической и ферментативной обработки сердечной мышцы лабораторных животных (мышей) помещают в культуральную среду следующего состава: 90% среды DMEM, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина, 25 мг/л инсулина, 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 10 нг/мл интерлейкина-6, 25 нг/мл фактора роста фибробластов, 10 нг/мл эндотелиального фактора роста- Новым в предлагаемом способе является использование последовательной механической и ферментативной диссоциации сердечной мышцы и состав культуральной среды. Заболевания сердца и сердечно-сосудистой системы являются наиболее распространенными во всем мире и занимают ведущее место в структуре заболеваемости и смертности населения нашей страны. Опасность для здоровья и социальная значимость данных заболеваний определяют необходимость постоянной разработки новых эффективных патогенетически обоснованных методов их фармакологической терапии и профилактики. Известно значительное количество медикаментозных и немедикаментозных способов профилактики и лечения заболеваний сердца с разнонаправленными механизмами действия. Вместе с тем благодаря развитию клеточных технологий на сегодняшний день и связанному с этим обнаружением в различных органах резидентных мультипотентных стволовых клеток (назначением которых является регенерация тканей в ответ на физиологическую убыль клеток, либо их гибель, вызванную повреждающим фактором) [3], появилась возможность создания новых патогенетически обоснованных методов лечения, в том числе болезней сердца [4], основанных на стимуляции пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. Однако, как было описано выше, для разработки таких методов необходим способ клонирования регионарных клеток-предшественников сердца, позволяющий изучать действие на них различных препаратов и веществ в условиях in vitro. Факт применения культуральной среды из используемых компонентов и их концентрация, в том числе добавление в среду указанной совокупности полифункциональных цитокинов, представляющих собой раннедействующие ростовые факторы, с разнонаправленными механизмами действия на функциональное состояние клеточных элементов, и использование сочетания механической и ферментативной обработки сердечной мышцы с целью ее диссоциации, с достижением нового результата: создание способа клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца взрослого организма, для специалиста является не очевидным. Используемый в предлагаемом изобретении способ диссоциации мышечной ткани и состав среды в совокупности являются оптимальными для клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца взрослого организма. Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не являющиеся очевидными для специалиста и не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют клонировать in vitro регионарные клетки-предшественники сердца взрослого организма, и предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение для создания новых способов лечения болезней сердца. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено. Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость». Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему чертежей. На фиг.1А – гетерогенная колония, выросшая на 7-е сут культивирования (микрофото нативного препарата), ув. 250 х; на фиг.1 Б – сплошной рост гетерогенных клеток на 14-е сут культивирования (микрофото нативного препарата), ув. 250 х. На фиг.2А – рост множества миоцитоподобных двухядерных клеточных элементов (микрофото гистологического препарата культуры на 14-е сут), окраска гематоксилин-эозин, ув. 250 х; на фиг.2Б – миоцит (микрофото гистологического препарата культуры на 14-е сут), окраска гематоксилин-эозин, ув. 600 х; Способ осуществляют следующим образом: Сердечную мышцу лабораторных животных (мышей) диссоциируют на отдельные клеточные элементы с помощью механической и ферментативной обработки, затем полученную взвесь клеток помещают в культуральную среду следующего состава: 90% среды DMEM, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина, 25 мг/л инсулина, 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 10 нг/мл интерлейкина-6, 25 нг/мл фактора роста фибробластов, 10 нг/мл эндотелиального фактора роста- Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 20 шт, массой 18-20 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). Пример 1. Способ осуществляют следующим образом. У мыши линии СВА/ CaLac, массой 20 г, умерщвленной с помощью дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом, в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром) извлекали сердце. Сердце дважды отмывали от эритроцитов в физиологическом растворе. Затем сердечную мышцу измельчали с помощью ножниц и помещали на 10 мин в раствор ЭДТА, содержащий 1,25 мг/мл трипсина, при комнатной температуре. После этого материал диссоциировали до получения клеточной взвеси, сначала путем пипетирования инкубационной среды при помощи шприца через иглу диаметром 2 мм в течение 5 мин, а затем с помощью гомогенизатора. После чего клеточный материал фильтровали через капроновую сеточку для удаления крупных агрегатов, дважды отмывали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5-10 мин и подсчитывали общее количество нуклеаров, определяя их жизнеспособность с помощью трипанового синего. Затем клетки помещали в среду следующего состава: 90% DMEM (“Serva”, ФРГ), 10% инактивированной ЭТС (“Sigma”, США), 6 г/ л глюкозы, 280 мг/л L-глугамина (“Sigma”, США), 50 мг/л гентамицина (“Serva”, ФРГ), 8000 МЕ/л гепарина (“Biochemie”, Австрия), 25 мг/л свиного многокомпонентного инсулина (“Novo Nordisk”, Дания), 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток (“Sigma”, США), 10 нг/мл интерлейкина-6 (“Sigma”, США), 25 нг/мл основного фактора роста фибробластов (“Sigma”, США), 10 нг/мл эндотелиального фактора роста- Предлагаемый способ позволяет in vitro клонировать регионарные клетки-предшественники сердца взрослого организма. Источники информации 1. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. – Томск: Изд-во ТГУ, 1992. – 272 с. Формула изобретения
Способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца, заключающийся в инкубировании клеток, помещенных в культуральную среду в СО2-инкубатор при 37°С, 5% СО3 и 100%-ной влажности воздуха, отличающийся тем, что сердечную мышцу лабораторных животных предварительно подвергают механической и ферментативной диссоциации, затем полученные клеточные элементы помещают в культуральную среду, а в качестве культуральной среды используют смесь следующего состава: 90% среды DMEM, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина, 25 мг/л инсулина, 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 10 нг/мл интерлейкина-6, 25 нг/мл фактора роста фибробластов, 10 нг/мл эндотелиального фактора роста-
РИСУНКИ
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 22.03.2008
Извещение опубликовано: 27.03.2010 БИ: 09/2010
|
||||||||||||||||||||||||||
и инкубируют в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха в течение 7-14 сут. Изобретение позволяет клонировать in vitro регионарные клетки-предшественники сердца взрослого организма. 2 ил.
