Патент на изобретение №2307349

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СОЧЕТАННОГО ПОРАЖЕНИЯ ОРГАНОВ ЦИСТНЫМ ЭХИНОКОККОЗОМ У ДЕТЕЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностическим методам в детской хирургии. Для осуществления способа из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят генотипирование полиморфизма гена, кодирующего фермент глютатион-S-трансферазу класса mu M1 методом полимеразной цепной реакции и при обнаружении делеционного генотипа GSTM1 0/0 у обследуемого прогнозируют риск развития сочетанного поражения органов цистным эхинококкозом и резидуальные кисты после хирургического лечения у детей. Использование изобретения позволяет на основе выявления молекулярно-генетических маркеров прогнозировать развитие заболевания.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”- indexed for MEDLINE]. KRAMMER B. et al. Echinokokkose im Kindersalter. Diag-nostische Moglichkeiten u Richtlinien zur Behandlung. Paediat. Prax. 63, 59-69 (2003) (пер. Богданов Ю.М.), [он-лайн] [найдено 24.01.2007]. IVASCHENKO Т.Е. et al. Glutatione-S-transferase micro and theta gene polymorphisms as new risk factors ofatopic bronchical asthma., J Mol Med/ 2002 Jan; 80(1): 39-43. Epub 2001 Sep 6. [он-лайн] [найдено 24.01.2007]. Найдено из базы данных PubMed, PMID:! 1862323 [PubMed – indexed for MEDLINE].

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к детской хирургии, и может быть использовано при прогнозировании риска сочетанного поражения органов и развития резидуальных кист после хирургического лечения у больных цистным эхинококкозом детей.

Авторами в научно-медицинской и патентной литературе не обнаружено сведений об известности способа прогнозирования сочетанного эхинококкоза у детей. В этой связи особую актуальность представляет определение прогностических критериев.

Разработанные в настоящее время клинические, иммунологические, инструментальные методы диагностики и прогнозирования сочетанного поражения органов эхинококкозом имеют следующие недостатки:

– отсутствие диагностических маркеров болезни на ранних этапах развития патологии из-за разнообразия клинических проявлений;

– недостаточно эффективные инструментальные методы при выявлении мелких кист;

– недостаточно чувствительные серологические реакции;

Нами выявлено, что среди детей, больных сочетанным эхинококкозом, значительна доля лиц носителей делеционного генотипа гена GSTM1. Таким образом, генотипирование детей, больных цистным эхинококкозом на выявление делеционного генотипа GSTM1 0/0, дает возможность прогнозировать риск сочетанного эхинококкоза и развитие резидуальных кист после хирургического лечения. Метод может быть использован в дополнение к известным способам диагностики для улучшения результатов. Он доступен по реактивам и оборудованию.

Техническим результатом изобретения является получение критериев прогнозирования риска развития сочетанного эхинококкоза и резидуальных кист после хирургического лечения у детей на основе выявления молекулярно-генетических маркеров.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивают и переливают в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трисHCl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8.0, суспензируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация – 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизании к лизату добавляют 0.5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1 М трисHCl до рН 7,8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем – хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н₂О; раствор хранят при t-20°C.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации нужного фрагмента.

Анализ полиморфных локусов гена GSTM1 проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на термоциклере в автоматическом режиме с использованием локусспецифических олигонуклеотидных праймеров 5GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3 и 5GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3

Схема ПЦР следующая. Реакционная смесь содержит 2,5 мкл 10 х ПЦР-буфера (60 мМ Tris-HCl рН 8.5), 1,5 мМ MgCl₂

Нами были исследованы дети (N=72), больные цистным эхинококкозом, проживающие в промышленных и сельскохозяйственных районах Республики Башкортостан. Контрольную группу составили практически здоровые лица. Группы обследованных пациентов и контроля были сопоставимы по возрасту, полу и месту жительства. Установлено, что у больных эхинококкозом частота встречаемости гомозигот по делеционному аллелю гена глютатион-S-трансферазы M1 составляет 32,9%. В контрольной группе практически здоровых индивидов этот показатель равнялся – 42,8%.

Статистический анализ результатов выявил достоверные различия между группами (²=6,13; р=0,01).

OR=(a×d)/(b×c)

где a – число лиц с наличием, b – с отсутствием маркера (генотипа GSTM1 0/0) среди больных сочетанным эхинококкозом; c и d – число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди больных солитарным эхинококкозом. Повышенный риск развития констатировали при OR>1.

Показатель относительного риска развития сочетанного поражения эхинококкозом для больных с генотипом GSTM1 0/0 оказался равным OR=4,33.

Пример 1. Больная З., 5 лет, поступила в хирургическое отделение с жалобами на боли в животе. После госпитализации и обследования выставлен диагноз: эхинококковая киста печени. Проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем делеционного генотипа GSTM1 0/0. В отношении развития резидуальных кист прогноз неблагоприятный.

Через 1 год после операции по поводу эхинококковой кисты печени поступает в клинику с жалобами на боли в груди, сухой кашель. Данные ультразвукового исследования органов грудной полости выявили жидкостное образование с четкими ровными контурами, размерами 91×62 мм, с толстой гиперэхогенной капсулой. После обследования выставлен диагноз: эхинококковая киста левого легкого.

Пример 2. Больная С., 7 лет, поступила в хирургическое отделение в 1999 г. с жалобами на боли в животе. После госпитализации и обследования выставлен диагноз: эхинококковая киста правой доли печени. Данные ультразвукового исследования выявили в правой доле (6-7 сегментах) жидкостное образование овальной формы с четкими ровными контурами 68×33 мм и анэхогенным ободком различной толщины. Перед операцией проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем нормального генотипа гена GSTM1. В отношении развития резидуальных кист прогноз благоприятный.

В 2004 г. поступила на контрольное исследование. Данные ультразвукового исследования выявили в правой доле печени остаточную полость размерами 17×5 мм. Признаков развивающейся кисты эхинококка у пациентки не обнаружено.

Формула изобретения

Способ прогнозирования сочетанного поражения органов цистным эхинококкозом у детей, характеризующийся тем, что из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят генотипирование полиморфизма гена, кодирующего фермент глютатион-S-трансферазу класса mu M1 методом полимеразной цепной реакции и при обнаружении делеционного генотипа GSTM1 0/0 прогнозируют риск развития сочетанного эхинококкоза и резидуальных кист после хирургического лечения у обследуемого.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 11.05.2008

Извещение опубликовано: 10.01.2010 БИ: 01/2010