Патент на изобретение №2307161
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В/60/Джилин/03/1 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ
(57) Реферат:
Изобретение относится к области вирусологии и иммунологии. Вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 – реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса В/Джилин/20/03 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 – донором аттенуации. Штамм активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32-33°С. Характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал от эпидемического вируса два гена, кодирующих поверхностные белки (гемагглютинин и нейраминидазу) и шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки от донора аттенуации. Штамм В/60/Джилин/03/1 ареактогенен для взрослых и для детей при интраназальном введении. Изобретение может быть использовано в медицине для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. 1 ил., 3 табл.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых и детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма В/60/Джилин/03/1. Известный вакцинный штамм вируса гриппа – В/60/Иоханнесбург/99/50 – прототип [Патент №2215786, гос. рег. 10.11.2003, Бюл. №3. Штамм вируса гриппа В/60/Иоханнесбург/99/50 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей] утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, аналогичного вирусу В/Джилин/20/03. Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса В/Джилин/20/03. Вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Джилин/20/03 с холодоадаптированным штаммом В/СССР/60/69 – донором аттенуации – с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к вирусу В/СССР/60/69. Донор аттенуации – холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа В/СССР/60/69, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб.: Наука. – 1994 – 151 с.]. Вакцинный штамм является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°С и 37°С составляет 7,0 lg ЭИД50/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°С и 25°С равна 3,0 lg ЭИД50/0,2 мл). Определение состава генома вакцинного штамма проводили методом сравнительного анализа электрофоретической подвижности одноцепочечных фрагментов РНК родительских вирусов и реассортантного клона в 2,8%-ном полиакриламидном геле (Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир. – 1982 – 446 с.) в присутствии 4,5 М мочевины. Вертикальный электрофорез проводили в течение 20 часов при +4°С при постоянном напряжения 100 V. Установлено, что вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS), от донора аттенуации и два гена, кодирующих поверхностные белки НА (гемагглютинин) и NA (нейраминидазу), от эпидемического вируса В/Джилин/20/03. Принадлежность гена, кодирующего поверхностный белок НА, эпидемически актуальному вирусу В/Джилин/20/03 была также подтверждена в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с 1% взвесью эритроцитов кур. Результаты анализа состава генома вакцинного штамма В/60/Джилин/03/1 представлены в табл.1 и на чертеже, где в качестве примера схематически представлен электрофорез одноцепочечных РНК в 2,8%-ном полиакриламидном геле в присутствии 4,5 М мочевины. 1-я дорожка – эпидемический вирус гриппа В/Джилин/20/03; 2-я дорожка – реассортантный вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1; 3-я дорожка – донор аттенуации В/СССР/60/69.
Таким образом, представленный вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью поверхностных белков эпидемического вируса В/Джилин/20/03, структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации. Штамм депонирован в коллекции Государственного института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича под №143. Морфология штамма – полиморфная, типичная для вируса гриппа. ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32-33°С в течение 72 часов – 7,5 lg ЭИД60/0,2 мл. Гемагглютинирующая активность – 1:512. Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз). Характеристики вакцинного штамма В/60/Джилин/03/1 представлены в прилагаемом паспорте. На основании их штамм использовали в приготовлении вакцины и проверили вакцину на волонтерах. ПАСПОРТ ШТАММА 1. Название штамма – В/60/Джилин/03/1 2. Серия – серия 1 3. Метод получения – реассортация; характеристика родительских вирусов: а) эпидемический вирус – В/Джилин/20/03 б) донор аттенуации – В/СССР/60/69 4. Количество пассажей – 6 в процессе реассортации 5. Характеристика штамма до лиофилизации: а) оптимальные условия репродукции – 32°С, 72 часа; б) гемагглютинирующая активность – 1:512; в) инфекционная активность – 7.5 lg ЭИД50/0,2 мл; г) чувствительность к ингибиторам – ингибиторочувствительный в РТГА с нормальной лошадиной сывороткой; д) разность в показателях инфекционной активности при 32°С и 37°С – 7.0 lg ЭИД50/0,2 мл; е) разность в показателях инфекционной активности при 32°С и 25°С – 3,0 lg ЭИД50/0,2 мл; ж) структура генома реассортанта: – гены от эпидемического вируса – НА, NA – гены от донора аттенуации – РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS 6. Характеристика штамма после лиофилизации: а) дата лиофилизации – 7 июля 2004 г. б) объем материала в ампуле – 1,0 мл; в) количество доз в ампуле – 4; г) инфекционная активность – 7.0 lg ЭИД50/0.2 мл; д) гемагглютинирующая активность – 1:256. 7. Рекомендуемое разведение при вакцинации – 1:2. 8. Антигенная специфичность: а) гемагглютинина в РТГА – идентичен вирусу В/Джилин/20/03, крысиной антисывороткой к которому полностью нейтрализуется; б) нейраминидазы – идентична вирусу В/Джилин/20/03 по данным электрофореза одноцепочечных вирионных РНК в 2,8% ПААГ в присутствии 4,5 М мочевины. 9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении – безвреден. 10. Бактериологический контроль: дата проведения – 9 июля 2004 года, результат – стерилен. 11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов – посторонние вирусы отсутствуют. ШТАММ – В/60/ДЖИЛИН/03/1 АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ ЛИЦ Пример 1. При вакцинации 53 взрослых человек интраназально реассортантным вакцинным штаммом В/60/Джилин/03/1 с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД60/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С и средних температурных реакций с повышением температуры в диапозоне 37,6-38,5°С не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°С) наблюдались в 7,55% случаев. Результаты обследования приведены в таблице 2. В группе из 42 лиц, получившей плацебо, слабые реакции наблюдались у 7,14% лиц, средние температурные реакции – у 2,38% и сильные температурные реакции – у 2,38%. Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%. Таким образом, вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения. ШТАММ В/60/ДЖИЛИН/03/1 АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ДЕТЕЙ 3-10 ЛЕТ Пример 2. Группу из 62 детей в возрасте 3-10 лет вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл реассортантным вакцинным штаммом В/60/Джилин/03/1 с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД60/мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 44 человек получила плацебо. Результаты исследований приведены в таблице 3. В группе вакцинированных детей сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С не наблюдались. Средние реакции в диапазоне 37,6-38,5°С также не наблюдались. Слабые температурные реакции с кратковременным повышением температуры до 37,5°С были отмечены в 8,1% случаев. В группе детей, получивших плацебо, наблюдались сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С и средние температурные реакции в диапазоне 37,6-38,5°С в 2,3% и 4,5% случаев соответственно. Слабые температурные реакции отмечены в 6,8% случаев. Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%. Испытания на волонтерах подтвердили, что вакцинный штамм В/60/Джилин/03/1 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения. На основе вышесказанного предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста, что подтверждают результаты изучения его реактогенности для разных возрастных групп.
Формула изобретения
Штамм вируса гриппа В/60/Джилин/03/1 ГИСК №143 (Государственный институт стандартизации и контроля имени Л.А.Тарасевича), используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей 3-14 лет.
РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
37,5 °С)
38,5°C)