Патент на изобретение №2307156

(54) ШТАММ ГРИБА Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ПРОТИВ ГРИБНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ СОСУДИСТЫХ БОЛЕЗНЕЙ И КОРНЕВЫХ ГНИЛЕЙ РАСТЕНИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биопрепарату для защиты растений, и может быть использовано против грибных возбудителей сосудистых болезней и корневых гнилей растений. Штамм Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott 3, выделен из ризосферы здорового хлопчатника, произрастающего на сероземной почве Ташкентской области, и депонирован в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ под номером D-553. Изобретение позволяет снизить заболеваемость растений, увеличить урожай и качество продукции. 5 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”тиксинообразование полевых штаммов Fusarium graminearum. Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук, 2002, №3, стр.22-23. HUANG H.C. Gliocladium catenulatum: hyperparasite of Sclerotinia sclerotiorum and Fusarium sp., Canadian journal of botany, 1978, vol.56, p.2243-2246.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биологическому способу защиты растений, и может быть использовано против грибных возбудителей сосудистых болезней и корневых гнилей растений.

Известен штамм Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott, депонированный в объединенной коллекции микроорганизмов ВНИИСХМ-ВИЗР 27 апреля 1990 года под регистрационным номером Д-43, выделенный с поверхности клубня сорта Невский с симптомами фузариозной гнили, отобранного в Ленинградской области [1].

Идентифицирование штамма проводилось по определителю G.V. Subramanian “Hyphomycetes” Indian Council of Agricultural Research. New Delhi, 1971, p.544.

Штамм Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ВНИИСХМ-ВИЗР Д-43 относится к классу Deuteromyces, порядку Moniliales, роду Gliocladium.

Штамм имеет следующую характеристику.

I. Культурально-морфологические признаки.

На картофельно-глюкозном агаре колония клочковато-пушистая, белая, с оливково-зелеными концентрическими зонами спороношения в центре колонии.

Конидиеносцы шероховатые около 100 мкм длиной. Кисточка трехъярусная, веточки 15-20×4 мкм, метулы 7-10×2,5 мкм, фиалиды 10-20×2 мкм. Конидии эллипсоидные 4-8×3-4 мкм, гладкие, светло-зеленые в длинных слизистых колонках.

Линейный рост колонии на агаризованных средах:

1. На сусло-агаровой среде – на 5-й день роста – 21 мм, на 10-й день – 30 мм, на 20-й день – 90 мм;

2. На картофельном агаре – на 5-й день роста – 28 мм, на 10-й – 44 мм, на 20-й день – 80 мм;

3. На среде Чапека на 5-й день роста – 21 мм, на 10-й день – 33,5 мм, на 20-й день – 63,5 м;

4. На овсяном агаре на 5-й день роста – 24,5 мм, на 10-й день – 43 мм, на 20-й день – 75,5 мм;

5. На картофельно-глюкозном агаре на 5-й день роста – 30 мм, на 10-й 45,5 мм, на 20-й день – 90 мм.

Спорообразование гриба на агаризованных средах на 21-й день роста:

1. На сусло-агаровой среде – 6.5×10⁶ конидий в 1 мл;

2. На агаре Чапека – 7,2×10⁵ конидий в 1 мл;

3. На картофельно-глюкозном агаре – 6,5×10⁵ конидий в 1 мл;

4. На картофельном агаре – 4,4×10⁵ конидий в 1 мл;

5. На овсяном агаре – 1,2×10⁷ конидий в 1 мл.

Спорообразование начинается на 5-й день роста, максимум спорообразования на 21 день.

II. Физиолого-биохимические свойства.

Из источников углерода усваивает глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, фруктозу, арабинозу, рамнозу. Хорошо усваивает нитратный, нитритный и аммонийный азот.

Растет в широких пределах рН от 2,0 до 9,0.

Продукт, синтезируемый штаммом, не устанавливался.

Признаки штамма устойчивые.

Штамм периодически пересевается и хранится в пробирках на картофельно-глюкозной среде и сусло-агаровой среде при температуре 20-25°С.

Штамм Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ВНИИСХМ ВИЗР Д-43 не патогенен для теплокровных животных.

Основным и наиболее опасным патогеном картофеля при хранении является гриб Fusarium sambucinum Fuck. В связи с этим отбор грибов-антагонистов проводился к наиболее вирулентному штамму Fusarium sambucinum Fuck. 34 Материалы и методы.

Объектами исследования служили грибы рода Gliocladium, Fusarium, Mortierella, Cladosporium, Verticillium, Penicillium, Trichocladium, Scopulariopsis, Paecillomyces и др., выделенные по общепринятой методике из клубней картофеля из разных областей Советского Союза. Всего проанализировано свыше 200 штаммов грибов.

Штаммы предлагаемых антагонистов выращивали на картофельно-глюкозно-агаровой среде в течение 20 суток в чашках Петри, затем из образовавшегося газона вырезали блоки 0,5 см в диаметре.

Тест-объект F.sarnoucinum культивировали на картофель-глюкозном агаре в течение 14 суток. Из выросших культур готовили посевную суспензию с титром 1×10⁶ макронидий в 1 мл. 0,1 мл суспензии F. sambucinum высевали газоном на поверхность застывшего картофельно-глюкозного агара в чашках Петри. В центре засеянных тест-обьектом чашек Петри располагали блок с предлагаемым антагонистом. Чашки Петри оставляли при комнатной температуре 22-25°С. Учет результатов опыта проводили на 6-е сутки. Среди исследованных штаммов нами отобраны изоляты, дающие зону задержки роста тест-культуры радиусом не менее 10 мм (табл.1). Высокой антагонистической активностью по отношению к возбудителю фузариоза F. sanbucinium обладали грибы рода Gliocladium и Paecillomyces, причем в отдельных случаях наблюдалось нарастание колонии антагониста на колонию тест-культуры.

Недостатками известного штамма Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ВНИИСХМ-ВИЗР Д-43 являются ограниченное использование штамма – для производства средств защиты растений против возбудителей заболеваний, а именно грибных фитопатогенов картофеля, непродолжительный срок использования приготовленного из штамма биопрепарата (суспензии штамма) – в течение 24 часов.

Известен штамм Gliocladium roseum A-5, выделенный со склероциев возбудителя белой гнили по общепринятой методике, который принимается за прототип [2].

G. roseum A-5 на сусло-агаре формирует колонии в молодом возрасте белого, затем – розового цвета. Интенсивность цвета колоний не является абсолютно постоянным признаком и может изменяться в зависимости от среды, освещенности, температуры. Конидиеносцы 150…230 мкм длиной и 4…6 мкм толщиной, очередно или мутовчато ветвистые с веточками до 125 мкм длиной, метулями до 75 мкм длиной. Стеригмы обычно по 3…5, 15…25 мкм длиной. Конидии яйцевидно-эллиптические или палочковидные, бесцветные, в массе кремово-розовые, иногда – с каплями масла на обоих концах – 3-12×2,5-4,5 мкм. G. roseum A-5 обладает способностью паразитировать на мицелии и склероциях возбудителя белой гнили подсолнечника. Он характеризуется гетерогенностью, природная популяция его состоит из большого числа штаммов, различающихся по характеру строения колоний, интенсивности споруляции и биологической активности по отношению к Whetzelinia sclerotiorum. Моноспоровые изоляты также проявляют гетерогенность. В культуре G. roseum A-5 растет медленно, формирует небольшие колонии: за 4…5 дней роста диаметр колоний достигает в среднем 3…5 см. За этот же промежуток времени колония Whetzelinia sclerotiorum способна покрывать всю чашку Петри, диаметр колонии 9 см. В двойной культуре между колониями образуется стерильная зона (0,7 см), на 14…15-е сутки совместного культивирования G. roseum A-5 начинает нарастать на колонию возбудителя белой гнили. На 28…29-е сутки все сформировавшиеся склероции и колонии возбудителя белой гнили покрываются розовым налетом G. roseum A-5. Пораженные антагонистом склероции Whetzelinia sclerotiorum, вновь высеянные на сусло-агар, дают начало росту G. roseum A-5. Из литературы известно, что этот гриб проявляет антагонизм при непосредственном контакте с другими грибами, поражает и разрушает споры и вегетативные клетки многих видов грибов и убивает своих хозяев только при непосредственном контакте с ним.

Недостатками прототипа – штамма Gliocladium roseum A-5 являются недостаточная скорость линейного роста гриба, накопления биомассы при выращивании на питательных средах, слабая приживаемость и размножение в более богатых гумусом и органикой дерново-подзолистых почвах и в дерново-подзолистых почвах + торф.

Решаемая изобретением задача – получение нового штамма гриба Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ГНУ ВНИИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ D553 для получения биопрепарата против грибных возбудителей сосудистых болезней и корневых гнилей растений.

Этот штамм активно развивается в почве, сохраняется длительное время – в течение вегетационного периода.

Использование: микробиологическая промышленность, сельское хозяйство, производство средств защиты растений против грибных возбудителей сосудистых болезней и корневых гнилей растений.

Поставленная задача решена тем, что в качестве деструктивного микопаразита с широким спектром антигрибной активности по отношению к фитопатогенным грибам, возбудителям сосудистых болезней и корневых гнилей растений используется штамм гриба Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ГНУ ВНИИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ D553 для получения биопрепарата против грибных возбудителей сосудистых болезней и корневых гнилей растений, депонированный в коллекции микроорганизмов Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии 19 марта 2004 года под регистрационным номером D-553 в группе мицелиальных грибов, выделенный из ризосферы здорового хлопчатника, произраставшего на сероземной почве Ташкентской области.

Штамм идентифицирован по определителю Н.М.Пидопличко “Грибная флора грубых кормов”, Киев, 1953.

Штамм гриба Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ГНУ ВНИИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ D553 для получения биопрепарата против грибных возбудителей сосудистых болезней и корневых гнилей растений относится к классу Deuteromyces, порядку Moniliales, роду Gliocladium.

Штамм имеет следующие характеристики.

1. Культурально-морфологические признаки.

Растет в аэробных условиях. Хороший рост при 20…27°С, растет в широких пределах рН от 4,0 до 8,5.

Штамм гриба Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ГНУ ВНИИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ D553 для получения биопрепарата против грибных возбудителей сосудистых болезней и корневых гнилей растений характеризуется хорошим ростом и спороношением при выращивании на агаровых средах – сусло-агар, картофельно-сахарозная среда, среда Чапека, крахмально-соевая, среда из отвара отрубей.

Спорообразование начинается на пятый день роста при 24…26°С.

Линейный рост колонии на агаризованных средах:

На сусло-агаровой среде на чашках Петри – на 14-й день роста -размером в 50 мм, на 20-й день – 80 мм.

На картофельном агаре на 14-й день роста – 45 мм, на 20-й день 90 мм.

На агаровой среде Чапека с сахарозой на 14-й день роста – 45 мм, на 20-й день – 85 мм.

При глубинном культивировании на минеральных и органических средах на качалке штамм растет в виде гомогенной массы бежевого цвета, иногда с зеленоватым оттенком.

Колонии на агаре Чапека белые, распростертые, пушистые, с конидиеносной зоной в центре колонии, оливково-зеленого или зеленого цвета, при старении темно-зеленого, разделенной 1-2 концентрическими кругами (зонами) стерильного светлого мицелия. Воздушный мицелий обильный, часто в виде гифальных тяжей. Конидиеносцы обычно однократно, иногда двукратно ветвистые, грубые, с шероховатой или точечной оболочкой 50-125 длины, с цепочками конидий, соединенными слизью в плотную колонку до 150 длины. Первичные веточки 15-20=3,5-4 ; метули 15-25 , стеригмы 10-20 длины. Конидии эллиптические, гладкие, бледно-зеленые 4-7,5=3-4 .

2. Физиолого-биохимические свойства.

При росте на среде Чапека из источников углерода усваивает глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, галактозу, лактозу, рафинозу, арабинозу, сорбозу, крахмал, глицерин. Из источников азота использует нитрат Na и нитрат К, сернокислый аммоний, нитрат аммония, хлористый аммоний, аммоний фосфорнокислый однозамещенный, пептон, лейцин, лизин, аспарагин.

Штамм образует антибиотики глиотоксин, виридин, а также энзимы – хитиназы и другие.

Антагонистическая активность по отношению к фитопатогену Verticillium dahliae изучалась методом блоков. На газоне со средой Чапека, засеянной суспензией конидий Verticillium dahliae зона отсутствия роста равнялась 2,5 см.

При изучении взаимоотношений грибов Gliocladium catenulatum с фитопатогенами Verticillium dahliae и Fusarium culmorum методом противоположных колоний наблюдалось постепенное нарастание антагониста на разросшуюся колонию фитопатогена, с последующим лизисом воздушного мицелия колонии V. dahliae и F. culmorum.

Штамм гриба Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ГНУ ВНИИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ D553 для получения биопрепарата против грибных возбудителей сосудистых болезней и корневых гнилей растений выращивается при 24°С для хранения на косяках в пробирках на картофельно-глюкозной среде Чапека с 0,5% кукурузного экстракта, на среде с 4% отвара отрубей и безуглеводной солевой – голодный агар. Пробирки с культурой гриба хранятся в холодильнике. Признаки штамма устойчивые. Периодичность пересева – 2 раза в год.

Штамм гриба Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ГНУ ВНИИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ D553 для получения биопрепарата против грибных возбудителей сосудистых болезней и корневых гнилей растений не патогенен для теплокровных животных.

Изготовленный на этом штамме биопрепарат продуцирует биологически активные вещества, в частности этилен, антибиотики, миколитические ферменты. В результате действия биопрепарата глиокладин снижается заболеваемость растений, снимаются острые формы поражения, ускоряется развитие растений, возрастает урожай и качество продукции.

Так, например, применение полученного на основе этого штамма биопрепарата позволило увеличить урожайность и сырую массу корней козлятника восточного в первый год жизни на 30…100%, количество активных клубеньков – в 1,5 раза – опыт №0302, 2002 г.

В 1992 г. были изучены новые штаммы Gliocladium catenulatum, выделенные из-под хлопчатника (сероземы) и с коллекционного участка земляники (дерново-подзолистая почва). В качестве эталона использовался штамм Gliocladium roseum 1-27, применяемый ранее для защиты хлопчатника от вертициллеза и ризоктониоза.

Изучение антагонистической активности штаммов Gliocladium в чашках Петри на газонах фитопатогенных грибов Verticillium dahliae и Fusarium solani позволило отобрать 3 штамма из сероземов и 3 штамма из дерново-подзолистой почвы. В таблице 1 представлены данные по изучению антагонистической активности штаммов. Активность оценивали по диаметру зоны отсутствия роста тест-объекта вокруг блока антагониста и по интенсивности воздействия антагониста на газон – степени просветления газона, что отмечено плюсами.

Оценка защитного действия штаммов грибов-антагонистов проводилась на сероземной почве +2 т/га лигнина в микровегетационном опыте, где в почву совместно с антагонистами были внесены микросклероции Verticillium dahliae 0,15 г/кг. Для сравнения в опыт были включены два производственных штамма – Trichoderma 10 и Trichoderma ЯЮ-1. Действие антагонистов на Verticillium dahliae в почве и на заражение хлопчатника вертициллезом представлено в таблице 2.

Как следует из таблицы, защитный эффект оказали все вновь изученные штаммы Gliocladium catenulatum и один штамм триходермы из двух. Наибольшая редукция зачатков Verticillium dahliae и высокий защитный эффект от болезни, равный штамму Gliocladium roseum 1-27, получены от штамма 3 Gliocladium catenulatum.

При переходе к испытаниям действия гриба Gliocladium catenulatum в других более богатых гумусом и органикой почвах и субстратах обращали особое внимание на приживаемость грибов-антагонистов в ризосфере растений. В закрытом грунте Северо-Западного региона применяются торфяные смеси и другая органика, что вызывает значительное развитие почвенной микрофлоры в них. Конкурентные отношения, складывающиеся между микрофлорой почвы и внесенными антагонистами, будут определять приживаемость последних в почве, отчего будет зависеть, в свою очередь, защитное действие интродуцентов.

В опыте на дерново-подзолистой почве + торф 1:1 препараты грибов Gliocladium catenulatum были внесены в тех же нормах, что и в опытах на сероземной почве, 1 г препарата на 1 кг почвы. Опыт ставился на нескольких фонах: без инфекции, на инфекционном фоне с Verticillium dahliae и Fusarium solani. В таблице 3 представлены данные по приживаемости штаммов Gliocladium catenulatum через 4 суток и через 3 недели, когда количество внесенных зачатков грибов обычно стабилизируется.

Как видно из таблицы, приживаемость у двух штаммов Gliocladium в данной почве очень разная. Штамм Gliocladium roseum 1-27 слабо приживается, что свидетельствует о его слабой конкурентоспособности. Подобные результаты были получены и в другом опыте на дерново-подзолистой почве, где были испытаны три штамма Gliocladium. Анализ приживаемости грибов, проведенный через 4 суток после их внесения, показал очень слабое развитие в почве штамма Gliocladium roseum 1-27, меньше 1 тыс./1 г.п. и хорошее развитие штаммов 3 и 3 Н Gliocladium catenulatum соответственно до 270 тыс./1 г.п. и 55 тыс./1 г.п.

После пополнения коллекции штаммов Gliocladium изолятами из дерново-подзолистой почвы – из питомника земляники в модельном опыте на вертициллезном фоне в сероземной почве были испытаны все 7 штаммов Gliocladium catenulatum. Определяли их приживаемость в почве и действие на зачатки Verticillium dahliae – таблица 4.

Как видно из таблицы 4, грибы антагонисты содержались в почве в достаточном количестве от 2 до 15 тыс./1 г.п.и оказывали подавляющее действие на зачатки Verticillium dahliae в почве. Наибольшую активность проявили два изолята Gliocladium из сероземов Gliocladium catenulatum 3 и Gliocladium catenulatum T и изоляты из дерново-подзолистой почвы, особенно Gliocladium catenulatum 4.

Проведено определение приживаемости этих штаммов на дерново-подзолистой почве через 5 суток после внесения биопрепаратов в почву. Как оказалось, по этому показателю штаммы Gliocladium очень отличались друг от друга. Слабо приживался штамм Gliocladium roseum 1-27 – 1 тыс./1 г.п., штаммы Gliocladium catenulatum 4 и Gliocladium catenulatum 17 размножились до уровня 7 и 3 тыс./1 г.п.соответственно. Хорошо размножались в дерново-подзолистой почве штаммы Gliocladium catenulatum 3 Н – 55 тыс./1 г.п. и особенно штаммы Gliocladium catenulatum 3 и Gliocladium catenulatum T – 270 и 320 тыс./1 г.п.соответственно. Поскольку антагонистическая активность штамма 3 Gliocladium catenulatum была достаточно полно изучена нами в лабораторных, модельных и вегетационных опытах, где он был лучшим по всем показателям, этот штамм был охарактеризован по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам и идентифицирован как штамм 3 Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott.

Была проведена также оценка фитотоксичности культуральной жидкости данного штамма по методике Берестецкого [2] на семенах огурца и томата. Для сравнения были взяты другие антагонисты и фитопатогенные грибы – таблица 5.

Как видно из таблицы 5, штамм 3 Gliocladium catenulatum не фитотоксичен, напротив, он оказывает стимулирующее действие на прорастание семян при их замачивании в культуральной жидкости этого гриба.

Таким образом, использование штамма 3 Gliocladium catenulatum, депонированного в коллекции микроорганизмов Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии 19 марта 2004 года под регистрационным номером D-553 – как штамм гриба Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ГНУ ВНИИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ D553 для получения биопрепарата против грибных возбудителей сосудистых болезней и корневых гнилей растений. Он позволяет расширить арсенал биологических средств борьбы с возбудителями сосудистых болезней и корневых гнилей растений.

Источники информации

1. Штамм гриба Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott для получения препарата против грибных возбудителей картофеля. Авторское свидетельство СССР №1836907, опубликовано 30.08.93. Бюл. №32.

2. М.Е. Штейнберг и И.А. Завелишко «Сравнительная характеристика некоторых изолятов Gliocladium – биологических агентов в борьбе с белой гнилью подсолнечника». Всесоюз. НИИ биол. методов защиты растений. Кишинев, Микробиол. Журн., 1988, т.50, №6.

Формула изобретения

Штамм гриба Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott ГНУ ВНИИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ D553 для получения биопрепарата против грибных возбудителей сосудистых болезней и корневых гнилей растений.