Патент на изобретение №2306696

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОЛЕРАНТНЫХ К ИОНАМ КАДМИЯ ОДНОДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ IN VITRO

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения однодольных растений, толерантных к ионам кадмия. Проводят культивирование каллуса, регенерацию и укоренение на среде Мурасиге-Скуга, причем культивирование проводят в течение 2 пассажей при концентрации кадмия 5-10 мг/л, а регенерацию при концентрации кадмия 10-30 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 20-30 мг/л. Изобретение позволяет получить однодольные растения с повышенной толерантностью к кадмию, 1 табл.

Область применения

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к клеточной инженерии, и может быть использовано как в городском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области общей экологии, физиологии и биотехнологии растений.

Уровень техники

Еще в одном способе был выделен табак, растущий при содержании в среде 100 мМ CdSO₄

В следующем способе отселектированная линия Lycopersicon peruvianum росла при концентрациях CdSO₄

Во всех перечисленных выше способах получить растения из линий, устойчивых к высоким концентрациям кадмия, не удавалось. Вероятно, это было связано с очень длительным культивированием (30-400 генераций).

Недостатком данного метода являлось длительное культивирование (в течение 14 пассажей) и использование прямой селекции, которая уменьшала регенерационную способность клеток и составляла 10-13% в зависимости от сорта. Данный метод не подходит для городских растений, т.к. в городе часто фиксируются более высокие концентрации кадмия – 20 и 30 мг/л.

Задачей нашего метода было исключить вышеизложенные недостатки других методов, увеличить процент регенерации и получить устойчивые к кадмию однодольные растения.

Раскрытие изобретения

Эта задача решается созданием нового способа толерантных к ионам кадмия однодольных растений in vitro, состоящего из культивирования, регенерации и укоренения на среде Мурасиге-Скуга, причем культивирование каллуса проводят в течение 2 пассажей при концентрации кадмия 5-10 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрацию кадмия 10-30 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 20-30 мг/ л кадмия.

Сущность изобретения

По мнению авторов сущность нашего метода заключается в коротком периоде культивирования и использовании ступенчатой селекции, что позволяет сохранить регенерационную способность клеток.

В данном методе была использована ступенчатая селекция, которая начиналась с адаптивных концентраций стрессового фактора (5-10 мг/л), и лишь после обогащения популяции резистентными клетками условия селекции ужесточали.

Устойчивость растений к тяжелым металлам обеспечивается молекулярными и физиологическими механизмами. Описан ряд соединений, для которых предполагают участие в детоксикации ионов тяжелых металлов. Возможно, существенную роль в формировании устойчивости к кадмию играют фитохелатины, которые образуют с ионами тяжелых металлов тиолатные комплексы.

Заявленные пределы определены следующим образом: при концентрации кадмия на стадии культивирования – более 10 мг/л более половины каллусов погибает и прирост составляет только – 28%, концентрация кадмия на стадии культивирования – менее 5 мг/л не является эффективной. При концентрации кадмия на стадии регенерации – более 30 мг/л крайне незначительная регенерационная способность (8%) и укоренение (18%). При концентрации кадмия – 60 мг/л наблюдается полная потеря регенерационной способности клеток. Использование концентраций кадмия менее 10 мг/л на стадии регенерации, менее 20 мг/л на стадии укоренения нецелесообразно для городских растений, так как в мегаполисах фиксируются более высокие концентрации кадмия. Кроме того, содержащиеся в почвах другие тяжелые металлы могут увеличивать токсичность кадмия. Культивирование каллуса полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera) и овсяницы красной (Festuca rubra) проводят в течение 2 пассажей, при увеличении количества пассажей наблюдается гибель большинства каллусных клеток. После культивирования в течение 2 пассажей регенерационная способность составляла – 40,5%, при культивировании в течение 3 пассажей эффективность метода снижалась, т.к. регенерационная способность составляла только – 30,0%.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, результаты по примерам представлены в таблице.

Пример 1.

Культивирование каллуса полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera) проводят в течение 2 пассажей при концентрации кадмия – 5 мг/л. Продолжительность пассажа составляла 1 месяц. При культивировании каллуса сильно проявлялась гетерогенность культивируемых тканей. Интенсивность роста отдельных инокулюмов различалась в полтора-два раза. Часть каллусов погибала при культивировании, а некоторые сохраняли рост на уровне контроля.

Регенерацию проводят при концентрации кадмия 10 мг/л. Укоренение проводят при концентрации 20 мг/ л, укоренить удалось только половину растений.

Пример 2.

Культивирование каллуса овсяницы красной (Festuca rubra) проводят в течение 2 пассажей при концентрации кадмия – 5 мг/л. Продолжительность пассажа составляла 1 месяц. При культивировании каллуса, также как у полевицы, сильно проявлялась гетерогенность культивируемых тканей.

Регенерацию проводят при концентрации кадмия 20 мг/л. Укоренение проводят при концентрации 20 мг/л, укоренить удалось только половину растений.

Пример 3.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят при концентрации кадмия 5 мг/ л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 20 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 30 мг/л кадмия.

Пример 4.

Проводят аналогично примеру 2, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят при концентрации кадмия 5 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 30 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 30 мг/л кадмия.

Пример 5.

Проводят аналогично примеру 2, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят при концентрации кадмия 7 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 10 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 20 мг/л кадмия.

Пример 6.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят при концентрации кадмия 7 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 20 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 25 мг/л кадмия.

Пример 7.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят при концентрации кадмия 7 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 20 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 30 мг/л кадмия.

Пример 8.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят при концентрации кадмия 7 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 30 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 30 мг/л кадмия.

Пример 9.

Проводят аналогично примеру 2, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят при концентрации кадмия 10 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 10 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 20 мг/л кадмия.

Пример 10.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводили при концентрации кадмия – 10 мг/л, затем проводили регенерацию, увеличивая концентрацию кадмия до 20 мг/ л и укоренение на среде Мурасиге-Скуга при концентрации кадмия 25 мг/ л кадмия.

Пример 11.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводили при концентрации кадмия – 10 мг/л, затем проводили регенерацию, увеличивая концентрацию кадмия до 20 мг/л и укоренение на среде Мурасиге-Скуга при концентрации кадмия 30 мг/л кадмия.

Пример 12.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводили при концентрации кадмия – 10 мг/л, затем проводили регенерацию, увеличивая концентрацию кадмия до 30 мг/л и укоренение на среде Мурасиге-Скуга при концентрации кадмия 30 мг/л кадмия.

Обсуждение результатов

Техническим результатом изобретения является прирост каллусной ткани, составляющий от 50,2% до 70,3%; регенерационная способность от 10,5% до 43,5%;укоренение 33,5-60,5%. Результаты изобретения показывают высокую эффективность данного метода, который позволил получить не только устойчивые клетки, но и высокий процент регенерации растений.

Всего в селективных условиях было получено 50 регенерантов полевицы. Большинство регенерантов полевицы имели нормальную морфологию и хороший рост и не отличались от обычных растений.

Для проверки устойчивости к высоким концентрациям кадмия регенеранты полевицы были высажены в почву со 50 и 100 мг/кг кадмия. 90% растений, полученных из кадмийустойчивых клеточных линий, росли при концентрации 50 мг/кг соли так же, как растения в почве без токсиканта.

Из 10 растений, растущих при концентрации соли кадмия 100 мг/ кг почвы, 8 имели рост и декоративные качества на уровне контроля, одно растение значительно отставало в росте и наблюдались обильные пожелтения, одно – погибло. Т.о. 80% росли при концентрации соли кадмия 100 мг/ кг почвы, также как и контрольные.

Таким образом, заявленный способ позволяет получить однодольные растения, устойчивые к высоким концентрациям кадмия.

Кроме того, неожиданным образом было получено, что 80% растений, полученных после селекции с кадмием, росли при концентрации нитрата свинца (0,4%) также хорошо, как и контрольные растения, растущие без токсиканта. При данной концентрации обычные растения не всходят, а у целых растений наблюдается очень значительное замедление роста (40% от контроля), некоторые растения погибают (20%).

Т.о. большинство растений-регенерантов, полученных из устойчивых к кадмию клеточных линий, обладало повышенной толерантностью к кадмию и свинцу. Следовательно, данный метод можно рекомендовать для получения однодольных растений, устойчивых к кадмию и свинцу.

Формула изобретения

Способ получения толерантных к ионам кадмия однодольных растении in vitro, включающий культивирование каллуса, регенерацию и укоренение на среде Мурасиге-Скуга, отличающийся тем, что культивирование каллуса проводят в течение 2 пассажей при концентрации кадмия 5-10 мг/л, затем проводят регенерацию при концентрации кадмия 10-30 мг/л и укоренение при концентрации кадмия 20-30 мг/л.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 26.01.2008

Извещение опубликовано: 10.11.2009 БИ: 31/2009